בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

Abstract

מקור: Fouda, A., et al., A Fluorescence מבוסס לימפוציטים Assay מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp., (2017).

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

Protocol

1. הכנת חיץ טחול בינוני וציטומטריית זרימה

1. בצעו את כל השלבים תחת מכסה מנוע ביולוגי של 70% אתנול שנוקה.
2. יש להסיר 70 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute שחומם מראש (RPMI) 1640 1x medium (זמין מסחרית ומסופק בבקבוקים סטריליים מסוננים בנפח 500 מ"ל) ומניחים בצינור סטרילי. המדיום שהוסר ישמש בהמשך הפרוטוקול.
3. להשלים את 430 מ"ל הנותרים של RPMI 1640 1x עם 50 מ"ל סרום בקר עוברי מומת (FBS), 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין, 5 מ"ל N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N-2-אתאן חומצה סולפונית (HEPES), 5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ"ל נתרן פירובט, 0.05 מ"ל מסונן (1M) 2-mercaptoethanol.
   הערה: מראש חם splenocyte בינוני באמצעות אמבט מים להגדיר על 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע תאים מזעזעים חום. זה חשוב כדי למנוע אינדוקציה של אפופטוזיס תאי.
4. להכנת מאגר ציטומטריית הזרימה, יש להוסיף 2 מ"ל FBS ל-98 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS) ולשמור בקירור עד לשימוש (רצוי תוך שלושה ימים).

2. יצירת תרחיף תאי טחול מטחול עכבר^{Nur77 GFP}

1. בודדו את הטחול מנקבת עכבר Nur77^GFP בת 6-8 שבועות.
   1. כדי להשיג זאת, לעבוד תחת מכסה מנוע סטרילי. השרו את פרוות העכבר שהוקרב, מספריים ומלקחיים באתנול 70%.
   2. הניחו את העכבר על צדו הימני, וחתכו את העור והשרירים ברביע הבטן השמאלי העליון. בדוק את אזור החתך כדי לאתר את הטחול באופן גלוי ואז לחתוך אותו. שמור את הטחול בתווך טחול על קרח עד מוכן לבצע את השלב הבא.
2. מניחים את הטחול בצלחת פטרי תרבית^{תאים בגודל} 10 ס"מ המכילה 5 מ"ל של מדיום טחול שחומם מראש.
3. מועכים את הטחול באמצעות בוכנה מזרק סטרילית עד התמיסה עכורה. מטריצת קולגן טחול צריכה להישאר בסוף ההליך.
4. לאחר מעיכה נרחבת בתווך טחול, אספו את תרחיף התא והעבירו אותו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר המונחת על צינור של 50 מ"ל כדי לסנן את כל הפסולת או קרישי הדם.
5. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-2-3 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים המיוצר או מסחרי. לאחר פיפטינג (2-3 פעמים) הניחו למתלים לנוח למשך 20-30 שניות.
6. הוסף 5 מ"ל של PBS או חיץ מתאים לבחירה ואז צנטריפוגר את מתלה התא למשך 5 דקות ב 500 x גרם.
7. הסר את supernatant (צריך להיות בצבע אדום כפי שהוא מכיל תאי דם אדומים lysed) ו להשעות מחדש את גלולת התא ב 2 מ"ל של טחול בינוני.
8. באמצעות המוציטומטר, ספור את מספר התאים המוכתמים בכחול טריפאן כדי להבדיל בין תאים חיים ומתים (נמקיים).

3. בידוד תאי T מתרחיף תאי הטחול

1. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 5 דקות ב 500 x גרם. השהה מחדש את התאים בתווך RPMI ללא סרום (50 מ"ל משלב 1.3) כדי לקבל ריכוז תאי של 10 x 10⁶ תאים / מ"ל.
2. מעבירים את התאים לצינור פוליסטירן של 5 מ"ל ומניחים בצד אליקוט של 100 מיקרוליטר של טחול להערכה/השוואה של טוהר בסוף שלב הטיהור.
3. הוסף סרום חולדות רגיל לתרחיף התא ב 50 μL / mL ואחריו קוקטייל נוגדנים לבידוד תאי T (50 μL / mL).
4. מערבבים את מתלה התא ונותנים לו לנוח במשך 10 דקות. שלב זה מאפשר לקוקטייל הנוגדנים לקשור את כל התאים הלא רצויים.
5. הוסיפו את הכדורים המהירים של סטרפטאבידין (חרוזים מגנטיים) למשך 2.5 דקות, ואז הביאו את הנפח ל-2.5 מ"ל באמצעות המדיום נטול הסרום.
6. הניחו את הצינור במגנט לבידוד תאים למשך 3 דקות.
7. מעבירים את מתלה תאי T לתוך צינור פוליסטירן חדש על ידי החזקת המגנט ושפיכת התמיסה במהלך אחד.
   הערה: התרחיף המבודד מכיל את תאי T מטוהרים. כל התאים הלא רצויים מוחזקים בצד הצינור הקשור לחרוזי הסטרפטווידין המגנטיים.
8. ספור את תאי T המבודדים באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר.
   הערה: בשלב זה, ניתן לאמת את טוהר תאי T המבודדים (אופציונלי) על ידי ניתוח אחוז אירועי CD3⁺ לפני ואחרי בידוד תאי T על ידי ציטומטריית זרימה.
   1. בקצרה, צנטריפוגה 1 מ"ל של תרחיף תא טחול ב 500 x גרם. השליכו את הסופרנאטנט והשהו את התאים במאגר ציטומטריית זרימה בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
   2. הוסף נוגדן CD3 נגד עכבר עם תיוג פלואורסצנטי בריכוז של 1:100. יש לדגור ב-4°C למשך 30 דקות. יש לשטוף פעם אחת, צנטריפוגה, ולהשהות מחדש במאגר ציטומטריית זרימה (400 μL) לניתוח לפי ציטומטריית זרימה.

4. הפעלת תאי T והשראת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)

1. זרעו את תאי T, בתרחיף, לתוך צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות בריכוז של 2.5 x 10⁵ תאים / באר.
2. הוסף אינטרלוקין רקומביננטי (IL)-7 ב- 2 ננוגרם/מ"ל וחרוזים מגנטיים CD3/CD28 (25 μL/10⁶ תאים). שמור על חלק מתאי T שאינם מטופלים בחרוזים כדי לשמש כבקרה שלילית למדידות מאוחרות יותר המייצגות תאי T שאינם פעילים.
3. שתים-עשרה שעות לאחר מכן, קצרו את תאי ה-T מהצלחת בעלת 96 הבארות על ידי פיפטציה עדינה של תרחיף התא בכל באר למעלה ולמטה כדי לשבור כל קומפלקס/אגרגטים של תאי חרוזים. לאסוף את התרחיף מכל הבארות לתוך צינור פוליסטירן 5 מ"ל.
4. הניחו את הצינורית המכילה את התרחיף בתוך אותו מגנט בידוד תאים ששימש בעבר לטיהור תאי T והניחו לו לנוח במשך 5 דקות.
5. מעבירים את מתלה תאי T לתוך צינור פוליסטירן חדש על ידי החזקת המגנט ושפיכת התמיסה במהלך אחד.
6. צנטריפוגה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות. להשהות מחדש את התאים בתווך טחול טרי כדי לקבל ריכוז של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
7. הערך את עוצמת ביטוי GFP על ידי ציטומטריית זרימה (אופציונלי לבקרת איכות) 12 עד 24 שעות לאחר הגירוי בהשוואה לתאי T שאינם מופעלים. ¹²
   הערה: פלואורסצנטיות GFP היא מהותית לתאי T^{של Nur77 GFP} ומתבטאת בהפעלה מוצלחת של קולטן תאי T, TCR.
8. להערכת כדאיות והפעלה (אופציונלי) על ידי מיקרוסקופיה, יש להכתים את התאים המופעלים ב-Hoechst 30 דקות לפני הניתוח בריכוז של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף נפח מתאים של מתלה התא למגלשת כיסוי או לבאר של צלחת שטוחה בעלת תחתית שחורה של 384 בארות ובדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך תאים חיים. תאים מתים לא ישמרו על כתמים גרעיניים.

5. סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות

1. הכן תרחיף תאים ב 2 x 10⁶ תאים / מ"ל של תאי T מופעלים (חרוזים מגנטיים או נוגדנים / CD40L) או קבוצות לא מופעלות.
2. צלחת 75,000 תאים/באר בצלחת של 384 בארות (נפח של 40 μL). השתמש בלוח שחור בעל תחתית שטוחה של 384 בארות או בשקופית כיסוי מיקרוסקופ לצורך הערכת כדאיות והפעלה במיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב בקרת איכות אופציונלי לפני HTS) באמצעות כתם Hoechst (עיין בשלבים 4.8 לקבלת פרטים).
3. באופן ידני או באמצעות מערכת אוטומטית, להוסיף את התרופות לפי בחירה (מומס ב 0.5% dimethyl sulfoxide, DMSO) לכל באר.
4. הוסף את הרכב (DMSO) לבארות בקרה חיוביות (מופעלות) ושליליות (לא מופעלות). התאם את ריכוז DMSO למקסימום של 0.5%.
5. דגרו על הצלחות במשך 24 שעות (או זמן דגירה לפי בחירה) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, CO₂.
6. ביום ההקרנה, יש לדלל את תמיסת הכתמים Hoechst 33342 (1:3,333; לדוגמה, להוסיף 10 μL לתאים בלוחות 384 בארות כדי ליצור נפח כולל של 50 μL). יש להכתים 30 דקות לפני ניתוח GFP על ידי הוספת תמיסת Hoechst להשגת ריכוז של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל.
7. טפטו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי לקבל פיזור הומוגני בכל באר.
   הערה: שלב זה חשוב במקרה של ניפוק התרופות (שלב 5.3) באמצעות מערכת אוטומטית מכיוון שהתאים נוטים להצטבר בצד אחד של הבאר, הפוך לכיוון הזרימה.
8. סובבו את הצלחות ב 45 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
9. השאירו את הצלחות לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
10. בצע הקראת לוחות, באמצעות המערכת האוטומטית לסינון תוכן גבוה קונפוקלי (HCS). טען את הצלחת למכונה. הציבו את היעד בהגדלה של פי 40 ומעלה. השתמש מצלמה #4 עבור Hoechst (מנורת UV) ומצלמה #1 עבור GFP (לייזר 488). הגדר את המכונה לקרוא 6-10 שדות לכל באר. כוונן את ההתקן לביצוע שתי קריאות רציפות לכל שדה ב- 488 ננומטר (לקריאת GFP) ואור UV (לקריאת Hoechst). הגדר את היעד להגדלה של פי 40 ומעלה.
    הערה: המערכת היא מיקרוסקופ ממוחשב שאינו דורש התאמות. מרחק המוקד, עוצמת אור האירוע וזמן החשיפה מוגדרים כולם באופן אוטומטי על ידי המכונה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
עכברי Nur77GFP	מעבדת ג'קסון	זן עכבר מס' 016617	מושבה ביתית הוקמה במתקן בעלי החיים שלנו
96 צלחות תרבות Wells-U, סטריליות	VWR הבינלאומי	10062-902	הפעלת תאי T באמצעות החרוזים המגנטיים
מסננת תאים 70μm, סטרילית	קורנינג בע"מ	352350	דור של תרחיף תאי טחול
5 מ"ל פוליסטירן צינורות תחתונים עגולים, סטריליים	קורנינג בע"מ	352058	דור של תרחיף תאי טחול
50 מ"ל צינורות תחתונים חרוטי פוליפרופילן, סטריליים	VWR הבינלאומי	89039-656	דור של תרחיף תאי טחול
מזרק 10 מ"ל ללא מחט, סטרילי	בקטון, דיקינסון ושות'	305482	לרסק את הטחול
5 מ"ל צלחת תרבית תאים, סטרילית	גריינר ביו-וואן	627 160	לרסק את הטחול
פניצילין- סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	WISENT בע"מ	450-200-EL	רכיב של מדיה splenocyte
RPMI 1600 עם סודיום ביקרבונט ו- L- גלוטמין	WISENT בע"מ	350-002-CL	רכיב של מדיה splenocyte
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	WISENT בע"מ	321-010-EL	רכיב של מדיה splenocyte
חומצה נטולת HEPES 1 M	WISENT בע"מ	330-050-EL	רכיב של מדיה splenocyte
תמיסת נתרן פירובט (100mM)	WISENT בע"מ	600-110-EL	רכיב של מדיה splenocyte
סרום בקר עוברי (FBS)	WISENT בע"מ	080-910	רכיב של מדיה splenocyte ו זרימה cytometry חיץ
מלח חוצץ פוספט (PBS)	WISENT בע"מ	311-010-CL	רכיב של מאגר ציטומטריה זרימה
2-מרקפטואתנול (55mM)	תרמו פישר סיינטיפיק	21985-023	רכיב של מדיה splenocyte
T- ערכת בידוד תאים	טכנולוגיות תאי גזע	19851	כדי לבודד תאי T
עכבר T-Activator CD3 / CD28 חרוזים superparamagnetic	תרמו פישר סיינטיפיק	11452ד	כדי להפעיל תאי T
מגנט לבידוד תאים	טכנולוגיות תאי גזע	18000	כדי לבודד תאי T ולהסיר את החרוזים המגנטיים
רקומביננטי מורין IL-7	פפרוטק	217-17	כדי לתמוך בהישרדות תאי T במהלך ההפעלה
נוגדן CD3 נגד עכבר	BD Pharmingen	561799	כדי להכתים תאי T עבור ציטומטריית זרימה
ביומד FXp	פרקיןאלמר בע"מ	A31842	כדי להשעות מחדש תאים לאחר 24 שעות דגירה
Opera Phenix מערכת סינון תוכן גבוהה	פרקיןאלמר בע"מ	HH14000000	כדי לנתח את אות GFP/Hoechst