$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבדקו על ידי מועצת הביקורת המוסדית המקומית.
1. הגדרת מכשירים
הערה: הדמיית תאים מרחפים דורשת שני מגנטים ניאודימיום נדירים של אדמה ממוגנטת על ציר z שימוקמו עם אותו קוטב זה מול זה כדי ליצור שדה מגנטי. ניתן להתאים את המרחק בין המגנטים בהתאם לעוצמת השדה המגנטי ולצפיפות המטרות. במקרה זה המגנטים מופרדים על ידי מרווח של 1 מ"מ המספיק להכנסת צינור נימי זכוכית מרובע באורך 50 מ"מ 1x1 מ"מ. המכשיר הודפס בתלת מימד באמצעות עיצוב AutoCAD, הזמין לפי בקשה.
- הנח מיקרוסקופ על צדו, אופקי לחלוטין.
הערה: מיקרוסקופ הממוקם במצב זקוף סטנדרטי אינו מתאים ישירות להדמיית עצמים מרחפים בשל מיקומי המגנטים ביחס למעבה ולמטרה. ניתן לעקוף מגבלה זו על ידי הנחת המיקרוסקופ על צידו, אופקי לחלוטין המאפשר למעבה למקד את האור לתוך הנימים, ועדשת האובייקט לדמיין את התא מרחף בין המגנטים, תוך שמירה על דרישות התאורה של קוהלר.
- תמכו ויישרו את המעמד על שולחן אב-טיפוס באמצעות 2 או 3 שקעי מעבדה.
- כדי להגביל רעידות, תמכו בשולחן לוח הלחם עם רגלי רטיבות גומי.
- הסר את ה-stage והחלף אותו בשקע מעבדה קומפקטי להתאמת גובה מכשיר הריחוף (-y-axis), ושני שלבי תרגום חד-ציריים; אחד לכוונון המיקוד (z-axis), והשני לסריקת צינור הנימים.
- חבר את מכשיר הריחוף המגנטי לשקע המעבדה באמצעות שני עמודים אופטיים מסדרה מיני.
2. קשירת נוגדן למיקרו-חלקיקים/חרוזים קרבוקסי (שונה מפרוטוקול על ידי PolyAn)
הערה: רק חרוזים בצפיפות נמוכה (1.05 גרם/מ"ל) צריכים להיות מצופים לזיהוי Rhesus, Rh(+), אך גם חרוזים בצפיפות גבוהה וגם בצפיפות נמוכה מצופים לזיהוי שלפוחיות חוץ-תאיות.
- יש להוציא 1 מ"ג שווה ערך לתרחיף חרוזים ולהוסיף ל-0.5 מ"ל של חוצץ הפעלה (50 מ"מ 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MW195.2, 9.72 מ"ג ב-1 מ"ל)) pH 5.0 ו-0.001% פוליסורבט-20).
- הוסף 12 מיקרוליטר של 1.5 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (MW 191.7, 0.28755 g ב-1 מ"ל) ו-12 מיקרוליטר של 0.3 M Sulfo-N-Hydroxysuccinimide (NHS) (MW 217.14, 0.0651 גרם ב-1 מ"ל) במים קרים כקרח.
- הניחו צינורות על שייקר אורביטלי ונערו במרץ במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל על החרוזים.
- הפסק את ההפעלה לאחר שעה אחת על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מאגר צימוד (10x מי מלח עם חוצץ פוספט, PBS או 0.1 M פוספט pH 7-9).
- גלול את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב-20,000 x g למשך 10 דקות, או, אם לא ניתן לגלול את החרוזים, השתמש במסנן צינור צנטריפוגה של 0.45 מיקרומטר. שאפו את הסופרנטנט או הזרימה.
- שוטפים את החרוזים עם 1 מ"ל של 10x PBS 3 פעמים כמו בשלב 2.5.
- חשב 25 מיקרוגרם נוגדן למ"ג חרוזים וערבב נוגדן רצוי עם חרוזים פעילים לריכוז נוגדן סופי של 0.7-1.0 מ"ג/מ"ל ב-10X PBS.
- הניחו צינורות על נדנדה צינור המכוונת במהירות נמוכה. גלגל צינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך הלילה לצימוד.
- חזור על שלב 2.5 ושטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 10x PBS.
- יש לשטוף עם 0.5 מ"ל של 1 M אתנולמין (98% מלאי = 16.2 M) ב-pH 8.0 עם 0.02% פוליסורבט-20 למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך ניעור עדין.
- חזור על שלב 2.5 ושטוף את החרוזים פעם אחת ב-1 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco. ניתן לאחסן את החרוזים ב-200 מיקרוליטר DPBS ב-4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. איסוף והכנת דם לזיהוי Rh(+)
- בעזרת מכשיר ריסוק בלחיצה אחת, דוקרים את אצבעו של תורם Rh(+) ואוספים 10 מיקרוליטר דם לתוך 1 מ"ל של DPBS.
- מכתים את תאי Rh+ עם כתם קרום פלזמה פלואורסצנטי. לחלופין, הוסף 1 מיקרוליטר של צבע פלואורסצנטי לתרחיף של 1 מ"ל של תאי Rh+ (דילול של 1:1000).
- דגרו על התאים עם הצבע הפלואורסצנטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- גלול את התאים על ידי סיבוב ב-5,600 x g למשך 15 שניות ושטוף 3 פעמים באמצעות 1 מ"ל של DPBS. יש להשעות 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס עם סידן ומגנזיום (HBSS++).
- בעזרת מכשיר הריסוק בלחיצה אחת, דוקרים את אצבעו של תורם Rh(-) ואוספים 2 מיקרוליטר דם.
הערה: אם מכינים יותר מ-2 מצבים, אספו מספיק דם כדי להוסיף 1 מיקרוליטר של דם Rh(-) לכל צינור.
- הכן את צינורות הניסוי הדרושים: חרוזים בלבד, בקרת אימונוגלובולין G (IgG), דגימה.
- חרוזים בלבד: מוסיפים 174 מיקרוליטר של HBSS++, 1 מיקרוליטר של חרוזי בקרה IgG, 1 מיקרוליטר של חרוזים בצפיפות גבוהה (1.2 גרם/מ"ל), ו-24 מיקרוליטר של 500 מ"מ Gd3+ (60 מ"מ).
- בקרת IgG: הוסף 172 מיקרוליטר של HBSS++, 1 מיקרוליטר של חרוזי בקרה IgG, 1 מיקרוליטר של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 מיקרוליטר של דם Rh, 1 מיקרוליטר של תרחיף דם Rh+ מוכתם, ו-24 מיקרוליטר של 500 מ"מ Gd3+.
- שפופרת הדגימה מוסיפה 172 מיקרוליטר של HBSS++, 1 מיקרוליטר של חרוזים מצופים נגד RhD, 1 מיקרוליטר של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 מיקרוליטר של דם Rh, 1 מיקרוליטר של תרחיף דם Rh(+) מוכתם, ו-24 מיקרוליטר של 500 מ"מ Gd3+.
הערה: חרוזים בצפיפות גבוהה מתווספים לדוגמאות Rh לעיון.
4. ניתוח תאים במכשיר הריחוף המגנטי
- בצע אתחול מכשיר בהתאם להוראות היצרן.
- טען 50 מיקרוליטר של דגימה לתוך צינור נימי עד למילוי הצינור. אטמו את קצות הצינור הנימי בחומר איטום נימי וודאו שאין בועות אוויר.
- טען את הצינור הנימי לתוך המחזיק בין המגנט העליון והתחתון. התאם את הבמה והמיקוד לצפייה אופטימלית.
הערה: תאים/חרוזים יכולים לקחת בין 5-20 דקות להגיע למצב שיווי המשקל המגנטי שלהם בהתבסס על הצפיפות שלהם וריכוז Gd3+. ככל שריכוז Gd3+ גבוה יותר, כך הזמן קצר יותר.