$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. בידוד תאי T CD4+ לניתוח תמונה
- הפשיר aliquot 1 מ"ל המכיל 107 תאים חד-גרעיניים בדם היקפי קפוא (PBMCs) או תאים חד-גרעיניים של בלוטות הלימפה (LNMCs) מדגימות שנאספו. במכסה מנוע סטרילי, מוסיפים את התאים המופשרים ל-9 מ"ל סל"ד בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין וגלוטמין.
- צנטריפואט התאים במשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C, לשאוף את supernatant ו resuspend את התאים ב 5 מ"ל של RPMI בתוספת המכיל 10% FBS (מדיום מלא). לדגור על התאים במשך הלילה באינקובטור CO2 ב 37 ° C.
- למחרת, לטהר תאי CD4+ T על ידי מיון אימונומגנטי שלילי באמצעות ערכה זמינה מסחרית על פי הוראות היצרן.
- כדי למדוד את מספר תאי T CD4+ מטוהרים טריים, ערבבו 5 μL של תרחיף התא עם נפח שווה של תמיסת טריפאן כחולה. לטעון hemocytometer עם תערובת תא-טריפאן כחול ולספור את התאים החיים בתוך 5 חלקים של hemocytometer.
- קח את הממוצע של מספר התא וקבע את מספר התאים בתרחיף התא המקורי: מספר התאים / 1 מ"ל = הספירה הממוצעת x 2 x 104. אם המספר הכולל של תאים מבודדים קטן מדי, השתמש בתאים כפי שהם מבלי לספור.
- צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם למשך 10 דקות והשהו אותם מחדש במאגר בדיקה (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, ו 1% אלבומין בסרום אנושי) ב 105 תאים / 50 μL או פחות ולשמור את התאים ב 4 ° C (במשך 1-2 שעות) עד מוכן שימוש בניסויים.
- יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית בהתאם להנחיות המוסדיות הרלוונטיות.
- אם תרצה כאוכלוסיית תאי ביקורת, הכינו תאי CD8+ T פעילים מ- PBMC של דם טבורי, הניחו 107 תאים ב -5 מ"ל של מדיום שלם בבקבוק תרבית T25 מכוסה בתערובת של נוגדנים נגד CD3 ואנטי CD28 ב -10 מיקרוגרם / מ"ל ו -1 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה.
- למחרת, הסר את תאי הדם הטבורי הפעילים מהבקבוק, שטוף אותם 1x עם מדיום שלם טרי, והרחיב את התאים בנוכחות IL-2 רקומביננטי (100 U / mL) במשך שבועיים.
- לטהר את תאי הדם הטבורי CD8+ T על ידי מיון אימונומגנטי שלילי באמצעות הערכה המסחרית הזמינה בהתאם להוראות היצרן. ספור את התאים והחלף את המדיה למאגר הבדיקה כמתואר בשלבים 1.3-1.6 עבור תאי T מסוג LN ו- PB CD8+ T.
2. רכיבים להכנת דו-שכבות השומנים המישוריות
- הכינו 3 סוגים של ליפוזומים כמתואר במקום אחר: (א) 0.4 מילימטר DOPC (1,2-דיולאואיל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין) ליפוזומים, (ב) 0.4 מילימטר ליפוזומים DOPC המכילים 33 מול% DOGS-NTA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (מלח אמוניום)) ליפידים, (c) 0.4 mM DOPC ליפוזומים המכילים 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotin) (מלח נתרן)).
- הכינו תמיסת קזאין 5% כפי שתואר קודם לכן.
- יש להמיס 5 גרם אבקת קזאין ב-100 מ"ל מים טהורים במיוחד ולהוסיף 350 מיקרוליטר נתרן הידרוקסידי בנפח 10 מ"ל. ערבבו הכל על מערבל מגנטי רגיל במהירות איטית בהתאם לקנה המידה הזמין, בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן למשך הלילה ב-4°C. התאימו את ה-pH ל-7.3 ובצעו אולטרה-צנטריפוגה של התמיסה למשך שעתיים ב-100,000 x גרם ב-4°C. סננו את הסופרנאטנט עם מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר ואחסנו את התמיסה ב-aliquots בטמפרטורה של -80°C.
זהירות: תמיסת נתרן הידרוקסידי עלולה לגרום לכוויות כימיות ועלולה לגרום לעיוורון קבוע במגע עם העיניים. השתמש בכפפות גומי, בגדי בטיחות והגנה על העיניים בעת טיפול בכימיקל זה או בתמיסותיו.
- תייגו נוגדנים נגד CD3 עם ביוטין כדי לייצר מולקולות נוגדנים מונו-ביוטינילציה בגישה שתוארה קודם לכן.
- הכינו תמיסה של ביוטין-PEO4-NHS בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) במינון 0.1 מ"ג/מ"ל. הוסף 3.7 μL של תמיסת Biotin-PEO4-NHS ל 1 מ"ג של נוגדנים ב 0.5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) המכיל 100 mM סודיום ביקרבונט.
- דוגרים על התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסה של אסטר Alexa Fluor 488 NHS במינון 10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. הוסף את תמיסת אסטר Alexa Fluor 488 NHS לנוגדן המסומן על ידי Biotin-PEO4-NHS בעודף מולארי פי 10.
- דוגרים על התערובת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך ערבוב איטי על בוחש מגנטי רגיל. הפרידו את הצבע הלא מאוגד באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.
- קבע את ריכוז הנוגדנים על ידי מדידת הצפיפות האופטית של תמיסת הנוגדנים ב- 280 ננומטר (A280). מדוד את הצפיפות האופטית של הנוגדנים המסומנים ב- 577 ננומטר (A577).
- קבע את יחס הצבע לנוגדנים באמצעות המשוואה הבאה:
הערה: מצא פרטים נוספים בפרוטוקול היצרן.
- בטא חלבון רקומביננטי מסיס מסוג Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) במערכת ביטוי דרוזופילה כפי שתואר קודם לכן.
- שיבוט, עם קידוד cDNA, האקטודומיין של ICAM-1 לווקטור ביטוי דרוזופילה pMT/V5-His עם מקדם מטלותיונין המושרה כדי לייצר חלבון רקומביננטי המצורף עם תג His6 בקצה מסוף C.
- Co-transfect תאי S2 עם ICAM-1 שנוצר המכיל פלסמיד ווקטור ביטוי גנטי (G418). בחר חומרי הדבקה יציבים באמצעות Drosophila Media של שניידר בתוספת 10% סרום עגל עובר (FCS) ו-0.5 מ"ג/מ"ל של G418 למשך 3 שבועות. הרחיבו את התאים בתווך חרקים ללא סרום וגרמו לביטוי חלבוני עם 0.5 mM CuSO4 עבור 3 d.
- לרכז את supernatant התרבות 10x ו dialyze מול PBS באמצעות רכז זרימה משיק כפי שתואר קודם לכן.
- יש למרוח את הסופרנאטנט המרוכז של התרבית על עמוד המכיל ספארוז עם נוגדן חד-שבטי אנטי-ICAM-1 משותק קוולנטית, ולנטרל את ה-ICAM-1 הכבול עם מאגר גליצין של 50 מילימטר, pH 3.0. נטרלו מיד את חלבון ICAM-1 המדולל עם חיץ 2M Tris, pH 8.0.
- נטרל את החומר המדולל כנגד PBS, pH 8.0, והוסף את החומר המדולל לעמודה המכילה Ni-NTA (חומצה ניקל-ניטרילואצטית) אגרוז. ICAM-1 מסיס Elute עם 200 mM imidazole, pH 8.0. דיאליזה של החומר המדולל כנגד מאגר PBS, pH 8.0.
- תייג את ICAM-1 מטוהר עם ציאנין5 N-Hydroxysuccinimide (Cy5 NHS) אסטר בהתאם להוראות היצרן.
הערה: יחס הצבע לחלבון הסופי הטוב ביותר הוא 1:1.
- לייצר מקטעי Fab מנוגדן anti-CD107a על ידי עיכול פפאין ולטהר את קטעי Fab על ידי כרומטוגרפיה חילופי יונים כפי שתואר קודם לכן. תייג את שברי Fab עם Alexa Fluor 568 NHS ester בהתאם להוראות היצרן.
3. היווצרות דו-שכבות ליפידים מישוריות נתמכות זכוכית
- הכינו תמיסת פיראנה חומצית טרייה על ידי ערבוב של 140 מ"ל חומצה גופרתית מרוכזת ו-60 מ"ל של 30% מי חמצן. שטפו את כיסויי הזכוכית עבור מגלשות הזרימה על ידי השרייתם בתמיסת הפיראנה החומצית למשך 30 דקות. החזיקו את כיסוי הזכוכית במלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן.
זהירות: תמיסת פיראנה היא מחמצן חזק במיוחד. זכור להרכיב משקפי בטיחות או משקפי מגן או מגן פנים מלא יחד עם כפפות גומי עבות בכל עת בעת הטיפול בתמיסה. עבוד רק עם תמיסת פיראנה מתחת למכסה אדים. יש להימנע מחימום, הובלה או טלטול בכל עת במהלך השימוש, שכן הוא עלול להתפוצץ. אספו את פסולת הפיראנה לתוך בקבוק זכוכית עם חור המכיל עופרת. יש לפנות לוועדת הבטיחות המוסדית בנושא ניצול נכון של הפסולת.
- שטפו את הכיסויים השטופים 7x במים טהורים במיוחד על ידי העברתם ברצף לכוסות המכילות מים מתוקים. הניחו את הכיסויים הרטובים בצד כדי לאפשר למים הנותרים להתגלגל מהזכוכית הנקייה, והשאירו את הכוס היבשה מאחור.
- לחלופין, השתמשו בקצה פיפטה המחובר למשאבת ואקום כדי להסיר בזהירות את טיפות המים הנותרות מהכיסויים.
- במכסה המנוע הסטרילי, בצע דילולים של שומנים שונים כדי לייצר את תערובת הליפוזומים להכנת דו שכבות. ראשית, ערבבו 37 μL של ליפוזומים DOPC ו-3 μL של ליפוזומים Biotinyl-Cap-PE. שנית, ערבבו 14 μL של ליפוזומים DOPC ו-15 μL של ליפוזומים של DOGS-NTA. שלישית, הוסף 1 μL של התערובת הראשונה ל 29 μL של התערובת השנייה כדי לייצר את תערובת הליפוזומים הסופית.
- במכסה המנוע הסטרילי, הגדירו סביבת עבודה עם כיסויים יבשים בקרבת מקום. Aliquot 2 μL של תערובת הליפוזומים הסופית (ראה שלב 3.3) בדיוק במרכז ערוץ שקופיות נדבק מעצמו. ישרו באופן מיידי ומדויק מאוד את הכיסוי הנקי והיבש עם המגלשה והורידו בעדינות את הכיסוי בצד הדביק של המגלשה.
- אם אתם מכינים יותר משקופית אחת, עבדו על שקופית אחת בכל פעם, מכיוון שתערובת הליפוזומים מתאדה במהירות. הפוך את המגלשה והשתמש בטבעת החיצונית של מלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי להפעיל לחץ עדין על המגע ההיקפי של הכיסוי עם המגלשה, וודא שההחלקה מחוברת היטב לשקופית כדי למנוע דליפה.
הערה: אין ללחוץ על ערוצי המגלשה כדי למנוע שבירה או סדיקה של הכיסוי.
- הפוך את השקופית שוב וסמן את המיקום של הדו-שכבה שנוצרה, שנראית כמו טיפה בין הכיסוי לשקופית הערוץ, על ידי ציור 4 נקודות עם סמן קבוע מסביב לשכבה הדו-שכבתית בצד השקופית החיצוני של ההרכבה.
- לפני ההזרקה הראשונה של נוזל לתעלה, ייעדו יציאה אחת של התעלה כיציאת הכניסה והשנייה כיציאת היציאה ושמרו על ייעוד זה לאורך כל הניסוי.
- כדי למנוע היווצרות בועות, הכנס את קצה קצה הצינור ישירות ליציאת הכניסה של התעלה. מלא באיטיות את ערוצי השקופית ב- 50 μL של חיץ בדיקה חם (לפחות בטמפרטורת החדר) (ראה שלב 1.5 עבור הרכב המאגר).
- הכינו תמיסת ניקל(II) כלוריד באורך 0.5 מ'. הפשיר 2 מ"ל aliquot של תמיסת קזאין באמבט מים ב 37 ° C במשך 30 דקות ולהשלים אותו עם תמיסת ניקל כלוריד בריכוז סופי של 200 μM.
- שטפו את הדו-שכבות על ידי הזרקת 100 μL של תמיסת הקזאין ביציאת הכניסה של התעלה ולאחר מכן הסרה מיידית של 100 μL מפתח היציאה במגלשה על ידי פיפטציה. חסום את שתי השכבות עם אותה תמיסה על ידי הזרקת 100 μL של תמיסת קזאין לתוך פתח הכניסה של כל תעלה ודגירה על המגלשה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- הפשרת אליציטוטים של Cy5-ICAM-1-שלו6 וחלבוני סטרפטווידין. ערבבו את החלבונים במאגר הבדיקה בריכוז הסופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד. צנטריפוגה את התמיסה למשך 30 דקות ב- 20,000 x גרם ו- 4 ° C כדי להסיר אגרגטים.
- הסר את שאר פתרון החסימה מיציאת היציאה של ערוץ השקופיות על-ידי פיפטציה. הזריקו 100 μL של התמיסה המכילה ICAM-1 וסטרפטאווידין ליציאת הכניסה.
- דוגרים על המגלשה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל עודף של תמיסת החלבון מפתח היציאה. שטפו את הדו-שכבה 2x על ידי הזרקת 100 μL של חיץ הבדיקה ביציאת הכניסה של התעלה ולאחר מכן הסרה מיידית של 100 μL מיציאת היציאה.
- יש לדלל נוגדן אנטי-CD3 עם תווית Alexa-Fluor-488 עם מאגר הבדיקה לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל. הזריקו 100 μL של תמיסת הנוגדנים לתוך פתח הכניסה של המגלשה ודגרו עליה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל עודף של תמיסת החלבון מפתח היציאה. שטפו את הדו-שכבה 2x עם 100 μL של מאגר הבדיקה כמו בשלב 3.11.
4. הדמיה של האינטראקציה של תאי T עם הדו-שכבה המישורית
- חממו מראש את השלב ואת המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי או השתקפות פנימית מלאה (TIRF) עד לשיווי משקל הטמפרטורה ב 37 °C. מקמו את המגלשה עם הדו-שכבתיים על הבמה המחוממת. הזיזו את הבמה למיקום מתאים בהתאם לסימני הדיו והתמקדו בשכבה הדו-שכבתית תוך שימוש בפלואורסצנטיות של מולקולות ICAM-1 עם תווית Cy.
- השתמש במטרה של 61X עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי, או במטרה של 100X עבור מיקרוסקופ TIRF, עם הגדרות מסנן מתאימות.
- להדמיית שחרור גרגירים במיקרוסקופ TIRF, הוסף מקטעי נוגדן Fab עם תווית Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a לתרחיף התא בריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל לפני הזרקת התאים ליציאות הכניסה.
- השהה מחדש את תאי CD4+ T שבודדו מ- LN PB או דם טבורי והזריק 50 μL של תרחיף התא ליציאת הכניסה של ערוץ השקופיות המכיל את הדו-שכבתי.
- בחר את מספר השדות הרצוי והקלט תמונות של כל שדה 1x כל 2 דקות במשך 30 דקות לאחר ההזרקה.
- נצל שדה בהיר, אור מוחזר ותעלות פלואורסצנטיות (Alexa 488 ו- Cy5) של המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי להשיג את התמונות. השתמש במצב TIRF עבור Alexa-Fluor-488 ו- Alexa-Fluor-568 פלואורסצנטיות ושדה רחב עבור פלואורסצנטיות Cy5, כמו גם הדמיה של שדה בהיר, במיקרוסקופ TIRF.