השפעת סוכן פרמקולוגי אימונומודולטורי על האינטראקציה בין תאים דנדריטיים ותאי T CD4+

תקציר

מקור: Wei, H., et al. פיתוח ואפיון תפקודי של תאים דנדריטיים טולרוגניים. J. Vis. Exp. (135), (2018).

סרטון זה מדגים שיטה להמרת תאים דנדריטיים (DCs) ל-DCs סובלרוגניים (TolDCs) באמצעות סוכן תרופתי אימונומודולטורי. המרה זו מאושרת על ידי הערכת הפונקציה TolDC באמצעות ההשפעה החיסונית שלהם על תאי CD4+ T.

פרוטוקול

1. להעריך את הפונקציה של TolDCs במבחנה וב- Vivo

1. בדיקת התפשטות סינגנית של תאי T
   1. לעקר את כל כלי הניתוח באמצעות autoclaving ולבצע את הניסוי בארון בטיחות ביולוגי סוג II עם נהלי בטיחות מתאימים.
   2. הכינו מאגר MACS באמצעות אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) ו-2 mM EDTA ב-500 מ"ל PBS. לעקר את המאגר על-ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
      הערה: שמור את החיץ על הקרח במהלך הניסוי הבא.
   3. כדי להשיג תאי T CD4+, הרדימו עכברים טרנסגניים קולטן תאי OT-II T (TCR) בגיל 8-10 שבועות באמצעות תא CO₂. הניחו את העכבר על לוח ניתוח ושטפו באתנול 70%. בודד את הטחול מצד שמאל של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים.
   4. שים את הטחול עם PBS 2 מ"ל בצלחת תרבית 6 ס"מ והשתמש בחלק האחורי של מקל הדחיפה של מזרק 3 מ"ל כדי לטחון את הטחול על ידי העברת מסננת תאים 40 מיקרומטר.
   5. אסוף את מתלה התא והצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   6. להשעות מחדש את גלולת התא ב 400 μl של מאגר MACS.
   7. הוסף 100 μl של קוקטייל נוגדנים CD4+ T Cell Biotin-Antibody ב 4 °C למשך 5 דקות.
      הערה: קוקטייל הנוגדנים נקשר לסוגי תאים אחרים למעט תאי T מסוג CD4+, כגון CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC Class II, Ter-119 ו-TCRγ/δ.
   8. הוסיפו 300 μl של מאגר MACS ו-200 μl של חרוזי אנטי-ביוטין (טבלה של חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
   9. הניחו את העמוד המורכב מכדוריות פרומגנטיות (טבלת חומרים) וממסנן קדם-הפרדה יחד בשדה המגנטי ושטפו אותו ב-3 מ"ל של חיץ MACS.
   10. הוסף 9 מ"ל של חיץ MACS בתאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   11. להשעות מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של מאגר MACS ולהחיל אותו על העמודה. אסוף זרימה דרך תאי CD4+ T.
   12. לשטוף את העמוד עם עוד 3 מ"ל של מאגר MACS וגם לאסוף את הזרימה.
   13. כדי להשיג DCs מחבת ספלנית, הרדימו עכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות באמצעות תא CO₂. הניחו את העכבר על לוח ניתוח ושטפו באתנול 70%. בודד את הטחול מצד שמאל של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים. הכניסו את הטחול לתבנית תרבית בקוטר 6 ס"מ המכילה 2 מ"ל תמיסת collagenase D (2 מ"ג/מ"ל collagenase D מומס ב-HBSS המכיל סידן ומגנזיום).
   14. הזריקו 1 מ"ל של תמיסת collagenase D לטחול פעמיים עם מזרק 1 מ"ל ומחט 25G. חותכים את הטחול לחתיכות קטנות עם מספריים קטנים.
   15. יש לנער ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות.
   16. הוסף 500 μl של 0.5 M EDTA בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
       הערה: השלבים מ-1.1.13-1.1.14 הם קריטיים להגדלת התשואה של DCs.
   17. כעת השתמש בחלק האחורי של מקל הדחיפה של מזרק 3 מ"ל כדי לטחון את תרחיף הטחול על ידי העברת מסננת תאים 40 מיקרומטר ולאסוף את מתלה התא על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   18. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-350 μl של מאגר MACS, 50 μl של מגיב חוסם FcR ו-100 μl של קוקטייל נוגדנים ביוטין-תאים פאן דנדריטיים בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
       הערה: קוקטייל הנוגדנים נגד אנטיגנים שאינם מבוטאים על ידי DCs.
   19. שטפו את התאים על ידי הוספת 9 מ"ל של חיץ MACS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   20. השהה מחדש את גלולת התא ב-800 μl של מאגר MACS והוסף 200 μl של חרוזי אנטי-ביוטין ב-4°C למשך 10 דקות.
   21. חזור על השלבים מ- 1.1.9-1.1.11 כדי לאסוף DCs.
   22. שטפו את העמוד עם עוד 3 מ"ל של מאגר MACS פעמיים וגם אספו את הזרימה.
   23. יש לטפל ב-2 x 10⁵ DCs/ml בנוכחות או היעדר 100-400 ננומטר CDDO-DFPA ב-37°C למשך שעה אחת. בנפרד, יש לתייג את תאי ה-T CD4+ (1 x 10⁷/ml) עם 1 μM CFSE ב-37°C למשך 15 דקות, לשטוף עם PBS ולהתאים מחדש את הנפח כדי לקבל את הריכוז הסופי ב-2 x 10⁶ תאי T/ml.
   24. לאחר מכן, בצלחת של 96 בארות, תרבית משותפת 100 μl של התאים הדנדריטיים המטופלים עם אותו נפח של תאי CD4+ T המסומנים ב- CFSE, שניהם נאספו מהשלבים לעיל כדי לקבל יחס של 1:10. כעת הוסף פפטיד 100 ng/mL ovalbumin (OVA) 323-329 לכל באר ומדוד את עוצמת CFSE של תאי T על ידי ציטומטריית זרימה לאחר 2-3 ימים של דגירה.
       הערה: מספרי התאים והיחס בין DCs ותאי T עברו אופטימיזציה מעבודתנו הקודמת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata פרמצבטיקה	בסינתזה ביתית	תרבית תאים
עכבר GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	בידול BMDC
ערכת בידוד תאים דנדריטיים פאן	Miltenyi ביוטק בע מ	130-100-875	בדיקת התפשטות תאי T
קוקטייל פאן דנדריטי תא ביוטין-נוגדנים	Miltenyi ביוטק בע מ	130-100-875	בדיקת התפשטות תאי T
ערכת בידוד תאי T CD4+	Miltenyi ביוטק Inc	130-104-454	בדיקת התפשטות תאי T
CFSE	ביולג'נד	423801	בדיקת התפשטות תאי T
מגיב חסימת FcR	Miltenyi ביוטק בע מ	130-100-875	בדיקת התפשטות תאי T
מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין	Miltenyi ביוטק בע מ	130-104-454	בדיקת התפשטות תאי T
1 מ"ל מזרק	BD Biosciences	309626	בדיקת התפשטות תאי T
BSA	סיגמא אולדריץ' בע"מ	A2058	בדיקת התפשטות תאי T
EDTA	תרמופישר סיינטיפיק	15575020	בדיקת התפשטות תאי T
עמודת LS	Miltenyi ביוטק בע מ	130-042-401	בדיקת התפשטות תאי T
מסנן קדם-הפרדה	Miltenyi ביוטק Inc	130-095-823	בדיקת התפשטות תאי T
קולגנאז D	סיגמא אולדריץ' בע"מ	11088858001	בדיקת התפשטות תאי T
HBSS	תרמופישר סיינטיפיק	14025076	בדיקת התפשטות תאי T
פפטיד אובלבומין (OVA) 323–329	סיגמא אולדריץ' בע"מ	O1641	בדיקת התפשטות תאי T