טכניקת מבחנה לדמיין אקסוציטוזה של גרגרי הפרשה בתאי פיטום

תקציר

מקור: Klein, O., et al. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה לדמיין אקסוציטוזה בתאי פיטום. התאים מודגרים עם FITC-dextran - כתב פלואורסצנטי - אשר נקלט על ידי תאים בתוך גרגירים מפרישים (SGs), שם ה- pH החומצי מרווה את הפלואורסצנטיות שלו. עם גירוי של אקסוציטוזה גרגירית, ה- pH הגבוה יותר של המדיום משרה פלואורסצנטיות כתב בתוך SGs מאוחים, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. הכנות

1. הכנת תרבית תרבית RBL (RBL-2H3 mast cell line)
   1. ערבבו 500 מ"ל של גלוקוז נמוך מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 56 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5.5 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין, 5.5 מ"ל של תמיסת L-גלוטמין 200 מילימול. התוצאה היא DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% FBS, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 12 יחידות / מ"ל nystatin, ו 2 mM L-גלוטמין.
   2. סנן את המדיה באמצעות מסנן ואקום עליון בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ואחסן ב- 4 ° C.
2. תחזוקה של תאי RBL.
   1. לגדל תאי RBL למפגש מקסימלי של 90% בצלחת של 10 ס"מ. אם תרבית התאים בריאה, התאים צריכים להיות בצורת ציר עם בליטות מדי פעם.
   2. לפיצול תאים, נתקו את התאים מהצלחת על ידי שאיפת המדיה והחלפתה ב-2 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA B. דגרו במשך 5-10 דקות באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ב-37°C.
   3. לאחר שהתאים התנתקו, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של תרבית מדיה, באמצעות פיפטה, ופצלו את התאים ביחס של 1:2 - 1:10.
3. הכנת חיץ 20x Tyrode
   1. הכינו תמיסת מלאי 20x של 54 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 2.74 M NaCl ו-8 mM NaH₂PO₄ במים מזוקקים כפול (DDW). מערבבים היטב ומאחסנים ב-4°C.

2. תרבית תאי RBL למיקרוסקופ תאים חיים

1. הכנת פתרון FITC-dextern.
   1. יש לערבב 1 מ"ג של אבקת פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן (150 K) לכל 1 מ"ל של חומר תרבית (ראה שלב 1.1.1). לכיסוי מלא יש להכין 3 מ"ל.
   2. באמצעות יחידת מסנן מזרק תאית אצטט בגודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר, סנן את FITC-dextearn המומס.
   3. הוסף אימונוגלובולין E (IgE) עכבר לריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל.
2. זריעת תאי RBL להדמיה
   1. יום לפני ההדמיה, שאפו את המדיה מצלחת התרבית והחליפו אותה בתמיסת טריפסין/חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) B. דגרו במשך 5 - 10 דקות באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר ניתוק התאים, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של תרבית מדיה.
   2. ספור תאי RBL באמצעות המוציטומטר וכוונן את עוצמת הקול בהתאם עם מדיה תרבית כדי לקבל ריכוז תא של 7.5 x 10⁵/mL.
   3. הוסף 10 μL של תרחיף התא לזכוכית כיסוי תאית מלאה מראש במצע תרבית טרי בתוספת FITC-dextran (התוצאה היא זריעה של 7.5 x 10³ תאים בתא).
   4. לגדל תאי RBL בן לילה באטמוספירה הוחה של 5% CO₂ ב 37 ° C. התאים צריכים להישאר ברמה תת-קונפלואנטית על מנת לוודא שהתאים מופרדים ושקל לזהות כל תא בנפרד תחת המיקרוסקופ.
3. טרנספקציה של תאי RBL - אופציונלי.
   1. להדמיית אירועים אקסוציטיים בשילוב עם חלבונים אחרים המתויגים באופן פלואורסצנטי, ראה פרוטוקול טרנספקציה עבור תאי RBL ב- Azouz et al.

3. מיקרוסקופ תאים חיים של אקסוציטוזה

1. הכנת פתרונות:
   1. הכינו תמיסת חיץ סופית של Tyrode על ידי דילול תמיסת המלאי ב-DDW בדילול של 1:20 והשלימו עם 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl₂, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל (BSA) וגלוקוז 5.6 מילימול.
   2. הכינו ריאגנט 20x בחיץ של Tyrode [1 מיקרוגרם/מ"ל דיניטרופניל מצומד לאלבומין בסרום אנושי (DNP-HAS (Ag)) במקרה שלנו, לריכוז של 50 ננוגרם/מ"ל 1x].
   3. הכינו תמיסת אמוניום כלוריד בנפח 400 מילימטר על ידי המסת האבקה במאגר של Tyrode.
2. הכנת התאים.
   1. שטפו את זכוכית הכיסוי התאית 3 פעמים על ידי שאיפת המדיה מהחדר ומילויה מחדש ב-300 μL של חיץ Tyrode, שחומם מראש ל-37°C. לבסוף, לחדש את החדר עם 300 μL של חיץ של Tyrode, מחומם מראש ל 37 ° C.
   2. הניחו את זכוכית הכיסוי התאית בתא האינקובטור של המיקרוסקופ. ודא כי החדר יציב.
3. הגדרת המיקרוסקופ
   1. כדי לבחור אזור מעניין למעקב, הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי (באופן מסורתי מנורת כספית) ובחר את מסנן הפלואורסצנטיות המתאים (בחר את המסנן עבור פלואורופורים ירוקים לצפייה ב- FITC-dextran). ברגע שאזור העניין נמצא בפוקוס ונמצא במרכז שדה הראייה, כבו את מקור האור כדי למנוע הלבנה ורעילות.
      הערה: חלק מה-FITC-דקסטרן המשולב בתאים עשוי לשמור על פלואורסצנטיות. הסיבה לכך היא כי FITC-dextran עשוי גם להיות ממוין לתוך תאים שאינם lysosomal כגון אנדוזומים.
   2. הפעל את התאורה המתאימה לעירור FITC. אם אתה משתמש במיקרוסקופ מבוסס לייזר, הפעל את הלייזר 488 ננומטר. יש לאסוף את הפליטה סביב 500 - 550 ננומטר (שיאי פליטת FITC ב- 510 - 520 ננומטר).
   3. בעת שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי, פתח את חור הסיכה למקסימום. זה יאפשר שימוש בעוצמת לייזר נמוכה יותר כדי למנוע הלבנה ורעילות ויבטיח לכידת אירועי אקסוציטוזה מכל מישורי התא.
   4. כייל את מרווח הזמן בין רכישות תמונה.
      1. תאים שונים עשויים להשתנות בקינטיקה שלהם של אקסוציטוזה מוסדרת. עבור הדמיה ספציפית של exocytosis מורכב, אנו ממליצים מרווח זמן של לפחות 5 שניות. עם זאת, ככלל אצבע, כדי לאפשר הדמיה מהירה, ודא כי זמן הרכישה של מסגרת אחת הוא מהיר.
      2. בעת שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, הגדר את כיוון הסריקה לדו כיווני, אל תאפשר ממוצע, והגדר את הרזולוציה על 512 x 512 (מומלץ; שתי ההוראות האחרונות יסייעו גם למזער הלבנה ורעילות).
4. הדמיה של exocytosis.
   1. תאי תמונה לפרקי זמן רצויים, בהתאם לסוג התא או הסוד. בתאי RBL המופעלים עם IgE/Ag, רוב האירועים האקסוציטיים מתרחשים תוך 15 - 20 דקות מההפעלה.
   2. להפעלת התאים, הוסף 16 μL מתמיסת הפרשה 20x לחדר.
5. אישור נוכחות FITC-dextran בתאים.
   1. כדי לאשר את נוכחותו ואת לוקליזציה של FITC-dextran ל- SGs, הוסף 16 μL של תמיסת אמוניום כלוריד (היזהר לא להזיז את החדר כדי לא לאבד את המיקוד) לתא בעדינות (זה יעשה ריכוז סופי של 20 mM). זה יגרום לאלקליזציה של SGs ו dequenching של פלואורסצנטיות FITC, אשר יתרחש בתוך שניות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM גלוקוז נמוך	השראות ביולוגיות	01-050-1א
סרום בקר עוברי	גיבקו	12657
פתרון Pen-strep-nystatin	השראות ביולוגיות	03-032-1B
תמיסת L-גלוטמין 200 מ"מ	השראות ביולוגיות	03-020-1א
FITC דקסטרן 150K	סיגמא-אולדריץ'	46946-500MG-F
תמיסת טריפסין/EDTA B	השראות ביולוגיות	03-052-1א	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש
מסנן ואקום עליון בגודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר	סיגמא-אולדריץ'	CLS430769-1EA
יחידת מסנן מזרק תאית אצטט, גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר	סרטוריוס	16534K
זכוכית כיסוי קאמרית	תרמו-מדעי	155411
צלחות תרבית טופלו בתרבית רקמה קורנינג	סיגמא-אולדריץ'	CLS430167
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A4503
IgE חד-שבטי אנטי-DNP	סיגמא-אולדריץ'	D8406
DNP-HSA (Ag)	סיגמא-אולדריץ'	A6661	יש להימנע מחשיפה ישירה לאור
חיץ Hepes 1M, pH 7.4	השראות ביולוגיות	03-025-1B
CaCl2	מרק	102382
גלוקוז	מעבדות BDH	284515V
אמוניום כלורי	מרק	1145
צינורות מלח דיפוטסיום	סיגמא-אולדריץ'	108321-27-3
סידן אצטט הידרט	סיגמא-אולדריץ'	114460-21-8
מגנזיום אצטט טטרהידראט	סיגמא-אולדריץ'	M5661
אשלגן גלוטמט (חומצה L-גלוטמית, אשלגן, מלח, מונוהידרט)	סיגמא-אולדריץ'	G1501
נה"ה 2ת.ד. 4	מרק	6346
NaCl	מרק	106404
MgCl2	מרק	105833
KCl	מרק	104936
אלקטרופורטור	BTX	ECM830
מיקרוסקופ קונפוקלי, Zeiss	זיס	LSM 5 פסקל, אקסיוברט 200 דקות	משמש באיור 3. מצויד בבקרת טמפרטורה אלקטרונית
חממת איירסטרים
מיקרוסקופ קונפוקלי, Zeiss	זיס	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	משמש באיור 2. מצויד בגלאי GaAsP, מבוקר טמפרטורה אלקטרוני;
חממת איירסטרים
מיקרוסקופ קונפוקלי, לייקה	לייקה	SP5	משמש באיור 1. מצויד בגלאי Leica HyD ואינקובטור שלב עליון (okolab)
תאי RBL-2H3			תאי RBL-2H3 שובטו במעבדתו של ראובן פ. סירגניאן. ראו הערה 67