ניטור הפעלת תאי B עם ליפוזומים אנטיגניים באמצעות בדיקת שטף סידן

תקציר

מקור: Bednar, K. J. et al., ליפוזומים אנטיגניים ליצירת נוגדנים ספציפיים למחלה.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מציג את הערכת הפעלת תאי B באמצעות שימוש בליפוזומים אנטיגניים. תאי B המטופלים בצבע Indo-1 הרגיש לסידן נבדלים באמצעות ציטומטריית זרימה, ויחס הפלואורסצנטיות הסגול-כחול שלהם מנותח. כאשר התאים נתקלים בליפוזומים אנטיגניים, זה מפעיל את הפעלת תאי B באמצעות זרם סידן, מה שמשפר בהדרגה את יחס האות הפלואורסצנטי סגול לכחול לאורך זמן.

פרוטוקול

1. הצמדה של אנטיגן חלבוני לשומנים PEGylated

1. הוסף 3 גרם של חרוזי ג'ל דקסטרן צולבים עם טווח שברים של 1,500-30,000 דלתונים (Da) לבקבוק ואקום של 250 מ"ל. הוסיפו 60 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) וערבבו ללא הרף עם מוט ערבוב מגנטי. אטמו את הבקבוק וחברו אותו לוואקום כדי להתחיל פירוק גזים על צלחת ערבוב למשך שעה לפחות.
2. בעמוד כרומטוגרפיה מזכוכית בגודל 1.0 ס"מ על 30 ס"מ עם פקק מחזור סגור, הוסף PBS לעמוד לכביסה. פתח את פקק התחלופה ונקז את העמודה. לאחר השטיפה, מוסיפים את תרחיף החרוזים ללא גזים לעמודה. מוסיפים ללא הרף את הבוצה עד שהעמוד ארוז לגובה חרוזים של כ-24 ס"מ.
3. ברגע שלעמוד יש 'ראש' של כ-4-5 ס"מ PBS מעל החרוזים הארוזים, הכינו את השלבים הבאים.
   1. צור סיפון זרימת כבידה על ידי מדידת חתיכת צינור ארוך מספיק כדי להגיע למדף 1-2 מטר מעל ראש העמוד וליצור לולאה שיורדת בסמוך לתחתית העמוד וחוזרת לראש העמוד. הוסף פקק תחלופה לקצה אחד של הצינור, והשאר צד אחד של הצינור פתוח. הניחו את קצה הצינור הפתוח לתוך בקבוק PBS בנפח 500 מ"ל והניחו אותו על המדף שמעל העמוד.
   2. קח את הסוף עם פקק התחלופה וחבר מזרק 10 מ"ל. פתח את שסתום פקק התחלופה בקו הצינור ומשוך PBS דרך הצינור. לאחר שה-PBS הגיע לשלושת רבעי הדרך דרך הצינור, הסר במהירות את המזרק והוסף את פקק התחלופה לחלק העליון של העמוד - הנוזל אמור לזרום על העמודה.
      הערה: כמות ה'ראש' של PBS שנותרה בחלק העליון של העמוד צריכה להיות בין 1 ל -3 ס"מ. הכמות המינימלית לשטיפת העמודה היא 3 כרכי עמודות.
4. לקבוע את כמות החלבון (שומות) להיות מקושר שומנים מבוסס על המשקל המולקולרי שלה (MW).
   הערה: מקטע Fab של אימונוגלובולין נגד עכבר עז, IgM (עצמו IgG) משמש כאן כאנטיגן חלופי אוניברסלי לגירוי רב-שבטי של תאי B. בהתאם לכך, לשבר העיזים IgG יש MW של כ-48 קילו-דלטון (kDa) והוא זמין מסחרית בכמות כוללת של 1.3 מ"ג. לפיכך, כמות החלבון להיות מקושר הוא 27.1 μmol.
5. לקבוע את מקדם ההכחדה של חלבון עניין. אם לא ידוע, למדוד את ספיגת החלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר ולחלק את הערך A₂₈₀ במספר השומות המחושב בשלב 1.4.
   הערה: מקדם ההכחדה של Fab של עז IgG ב 280 ננומטר הוא 64,600 ^M-1.
6. כדי להבטיח שכמויות זעירות של המאגר המכיל אמין יוסרו, התפלו את החלבון על העמוד שנוצר בשלבים 1.1–1.3 ואספו שברי חלבון לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל (~500 מיקרוליטר לשבר).
   1. סגור את שסתום פקק התחלופה המחובר לראש העמודה והסר את החלק העליון של העמודה. אם עדיין לא פתוח, פתח את שסתום פקק התחלופה בתחתית הטור והמתן עד שה'ראש' של PBS יפגע בחלק העליון של החרוזים.
   2. מוסיפים באיטיות את החלבון המעניין לחלק העליון של החרוזים באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, תוך הקפדה על מזעור הפרעות לחלק העליון של החרוזים.
   3. לאחר שה'ראש' של תמיסת החלבון הגיע לחלק העליון של החרוזים, הוסיפו 1 מ"ל PBS בעדינות באמצעות פיפטה של פסטר. חזור על הפעולה שלוש פעמים. הוסף PBS ליצירת ראש של 4-5 ס"מ וחזור על שלב 1.3 כדי לשטוף את העמודה.
      הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם בטוח שאין מאגר המכיל אמין.
7. לקבוע את השברים המכילים חלבון על ידי מדידת ערכי A280 ולאגד את השברים שנותנים כ 90% התאוששות של החלבון.
   הערה: זה בדרך כלל מדלל את החלבון פי 1.5-2. קבע את ריכוז החלבון לאחר איגום. רכז את החלבון בשלב זה, במידת הצורך, באמצעות רכז צנטריפוגה.
8. הוסף 2.5 שווה ערך מולארי של crosslinker heterobifunctional לחלבון.
   1. ראשית, לשקול כ 5 מ"ג של succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP, MW = 314 g/mol) לתוך צינור microcentrifuge. כדי לקבוע את הנפח להמסת SPDP, ריכוז חלבון מולארי takmultiplye ו 250x כדי ליצור תמיסה 100x שתיתן עודף מולארי 2.5 בתגובה.
      הערה: לדוגמה, אם ריכוז החלבון הוא 50 מיקרומטר, יש צורך בתמיסה של SPDP ב-12.5 מילימול. עבור 5 מ"ג של SPDP, זה מתאים 1.27 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO).
9. הוסיפו SPDP לחלבון המעניין בדילול של 1:100. הניחו את התגובה על שייקר מתנדנד בטמפרטורת החדר (RT) למשך כשעה.
10. כדי להסיר SPDP עודף ולהגן על הקשרים הדיסולפידים האנדוגניים, בחלבון בשלב ההפחתה שלאחר מכן, יש לאזן ולשטוף את העמודה שנוצרה בשלבים 1.1-1.3 ב-100 מילימטר נתרן אצטט (NaOAc) ב-pH 5.5 או ליצור עמודה זהה לשימוש במאגר זה בלבד.
11. לאחר דגירה של שעה אחת עם SPDP, התפלת החלבון על העמוד בשיווי משקל של 100 mM NaOAc. בצע שלב זה באופן זהה לשלב 1.6 למעט שימוש ב- 100 mM NaOAc (pH 5.5) כ- eluent. אסוף את השברים, קבע את A₂₈₀ ואגם את השברים העליונים. שטפו את העמוד ב-PBS.
12. הכינו תמיסה של 2.5 M של DTT (MW = 154 g/mol) במים מזוקקים כפול (ddH₂O). הוסף 25 mM DTT לשברי החלבון המצטברים למשך 5-10 דקות.
13. מודדים את A₂₈₀ של החלבון ומחלקים אותו במקדם הכחדה. כמו כן, לקבוע את A₃₄₃. חשב את יחס הקישור בהתבסס על המולריות של חלבון (A₂₈₀) ומקשר (A₃₄₃).
    הערה: בטל את הכיול האוטומטי של A340 אם אתה משתמש בספקטרופוטומטר ננו-טיפות. מדידת A₃₄₃ מייצגת את הספיגה של קבוצת פירידין 2-תיון (מקדם הכחדה = 7550 ^M-1) שהוסרה מהקרוס-לינקר SPDP על ידי ה-DTT. יחס מולארי של מקשר: יחס חלבון של 1.2-1.5 מושג בדרך כלל בעת ביצוע התגובה עם עודף מולארי של 2.5 SDPD על מגוון רחב של חלבונים.
14. הפעל את השברים המאוגמים מעל העמודה שנשטפה ב- PBS כמתואר לעיל. אסוף את השברים, קבע את A₂₈₀ וחבר את השברים העליונים. קבע את ריכוז החלבון על ידי A280 לאחר איגום השברים.
15. הכן DSPE-PEG(2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. זה יתווסף לחלבון ביחס מולארי של 10:1. הכן מלאי 100x של DSPE-PEG(2000)-Maleimide כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
    1. לדוגמה, אם ריכוז החלבון הוא 10 מיקרומטר לאחר שלב 1.14, להכין מלאי של DSPE-PEG(2000)-Maleimide ב 10 mM. שקול בזהירות את DSPE-PEG(2000)-Maleimide (MW = 3000 גרם / mol) והוסף את הכמות המתאימה של DMSO. סבבים מרובים של מערבולות עדינות וסוניקציה עשויים לגרום לו להתמוסס לחלוטין.
16. קבע את הנפח הכולל של השברים משלב 1.14 והעבר את התמיסה בזהירות לתוך בקבוק תחתון עגול קטן (10-25 מ"ל) (RBF). הוסף את הכמות המתאימה של 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimide לחלבון כדי להשיג עודף מולארי פי 1, פי 10, ריכוז סופי. ערבל בעדינות את הפתרון כדי להבטיח שה- DMSO מפוזר במלואו.
17. הריצו את התגובה במשך הלילה תחת חנקן ב-RBF אטום. השתמשו במחיצת גומי והניחו אותה במכסה אדים.
    1. הסר את האטמוספירה על ידי ניקוב המחיצה עם מחט 20 G המחוברת למזרק 3 מ"ל בקצה הצינור המחובר לוואקום, והפעל את הוואקום למשך 3-5 שניות.
    2. החליפו את האטמוספירה בחנקן. ממלאים בלון המחובר למזרק 3 מ"ל חתוך לשניים בחנקן ומחברים מחט 20 גרם. נקבו את המחיצה כדי למלא את האטמוספירה בתוך הבקבוק התחתון העגול בחנקן. חזרו על הסרת האטמוספירה והחלפתה בחנקן פעם נוספת והשאירו את בלון החנקן מחובר למשך הלילה.
18. הכינו עמוד חרוזי דקסטרן ג'ל נפרד עם טווח שברים של 4,000–150,000 Da בעמוד כרומטוגרפיית זכוכית בגודל 1.0 ס"מ x 50 ס"מ (לפי שלבים 1.1-1.3).
19. למחרת, הסר את החלבון מהבקבוק התחתון העגול שהוכן בשלב 1.17 והפעל (בצע את השיטה המשמשת בשלב 1.6) על עמודת חרוזי ג'ל דקסטרן צולבת (משלב 1.18).
    הערה: הסכום הכולל לטעינה על העמודה צריך להיות לא יותר מ 2 מ"ל. אם נעשה שימוש בתגובה גדולה יותר, פצל לשניים והפעל על טורים נפרדים או הפעל על עמודה בקוטר גדול יותר.
    1. לאסוף את השברים, לקבוע את A₂₈₀, מאגר שברים עליונים, ולקבוע את ריכוז החלבון. נוכחות השומנים לא תשפיע על המדידות.
20. אחסנו את השברים הסופיים של חלבון המקושר לשומנים בטמפרטורה של 4°C עד להכנה לשימוש.

2. הכנת ליפוזום

1. לשקול את השומנים: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (פוליאתילן גליקול)-2000, MW = 2805.5 גרם / מול; כולסטרול (3b-הידרוקסי-5-כולסטן, 5-כולסטן-3b-ol), MW = 386.7 גרם/מול; ו- DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. צור תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל של DSPC, תמיסת 4 מ"ג/מ"ל של כולסטרול ותמיסת 2 מ"ג/מ"ל של DSPE-PEG (2000) בכלורופורם.
2. ודא שהיחס המולרי של שומנים בליפוזומים הוא: 57% DSPC, 38% כולסטרול ו-5% DSPE-PEG (2000), כפי שמיוצג בטבלה 1.
   הערה: חשוב לשלוט על כמות האנטיגן על הליפוזום, אשר בדרך כלל נע בין 0.01-0.1%. בטבלה 1 נעשה שימוש ב-0.1% ממקטע IgM Fab נגד עכבר עיזים המקושר לשומנים מסוג PEGylated. חשוב לקחת בחשבון את העודף המולרי פי 10 של DSPE-PEG(2000)-Maleimide שנוסף לחלבון בשלב 1.15, כדי להבטיח שהכמות הכוללת של שומנים PEGylated לא תעלה על 5%.
3. שקול את כמויות השומנים הסופיות (μmol) בעת יצירת שומנים עבור אקסטרוזיה. ראו טבלה 1 כדוגמה לחישוב ריכוזי שומנים מולאריים ליצירת ליפוזומים בריכוז שומנים כולל של 1.25 מיקרומטר.
4. לאחר שחושבה הכמות הנכונה של כל שומנים שיש להוסיף יחד, ערבבו את כולם למבחנה מזכוכית בורוסיליקט 12 מ"ל.
5. בזהירות לנשוף את כלורופורם.
   1. השתמש צינור מזרק 3 מ"ל עם מחט, מוכן בשלב 1.17.1, בזהירות לנשוף כלורופורם בצינור עם חנקן. נשפו בעדינות זרם של חנקן על התמיסה תוך כדי סיבוב הצינור ביד השנייה. היזהר למזער התזה או גרימת הנוזל לזרום במעלה הצד של הצינור מכיוון שייתכן שיהיה קשה יותר להכניס את זה לתמיסה בשלב הבא.
6. הוסף 100 μL של DMSO לכל צינור ו lyophilize פתרון זה בן לילה. מכסים את החלק העליון של הצינור במגבון מעבדה לא סטטי, מאבטחים אותו בגומייה ומקפיאים בטמפרטורה של -80°C.

3. שחול ליפוזום

1. הוסף 1 מ"ל של PBS המכיל את החלבון המקושר לשומנים לצינור 12 מ"ל המכיל את השומנים. סוניק את התמיסה למשך כ-30 שניות עד דקה באמבט מים של סוניקציה. יש לנוח במשך 5 דקות או יותר בין כל סבב ולחזור על הפעולה 3-4 פעמים.
2. הכן מכבש לפי הוראות היצרן.
   1. הוסיפו את תומכי המסנן לתמיכה הפנימית של הממברנה, והניחו כמה טיפות (10 מיקרוליטר כל אחת) של PBS על סרט פרפין. בעזרת פינצטה, תפסו קצה של תמיכת המסנן וטבלו אותו בטיפה של 10 μL.
   2. מקמו את המסנן בתוך טבעת ה-O. עשו זאת עבור שני הצדדים. בעזרת פינצטה, תפסו מסנן של 0.8 מיקרומטר בקצה, טבלו בטיפה של 10 מיקרוליטר, וציפו את החלק החיצוני של טבעת ה-O עם PBS. הניחו את מסנן ה-0.8 מיקרומטר בעדינות על טבעת ה-O כדי שהמסנן לא יעמוד מעל התמיכה הפנימית של הממברנה.
3. הניחו את בלוק החימום של המכבש על פלטה חמה כדי לחמם מראש את המכבש. הפעילו את הפלטה החמה על אש נמוכה ואפשרו לבלוק החימום של המכבש להגיע לטמפרטורה הרצויה. כדי למנוע בעיות פוטנציאליות עם צבירת חלבונים, אין לחמם את הבלוק מעבר ל-37°C.
4. טען את הדגימה הסוניק לאחד מזרקי האקסטרודר שהונחו במכבש. מניחים את מזרק המכבש בקצה השני של המכבש. ודא שהבוכנה הריקה של המזרק מוגדרת לאפס. המזרק הריק יתמלא כאשר השומנים מושחלים דרך קרום הפוליקרבונט 0.8 מיקרומטר. נסו להימנע מהעברת בועות הלוך ושוב דרך הממברנה.
5. הכניסו את המכבש המורכב במלואו לבלוק החימום. דוחפים בעדינות את הבוכנה של המזרק המלא עם שומנים למזרק הריק. בהתאם לריכוז השומנים, זה יהיה קשה לדחוף. חזור על הפעולה 20x.
6. הסר את המכבש שהורכב במלואו מבלוק החימום. הסר לאט את המזרק המלא מן המכבש, הקפד לאסוף את כל השומנים שעלולים לדלוף החוצה בעת הסרה. הכניסו ליפוזומים לבקבוקון נקי. חזור על שלבים 3.4-3.6 באמצעות פוליקרבונט 0.2 מיקרומטר ו 0.1 מיקרומטר ממברנות.
7. צור עמוד חרוזי אגרוז צולב בגודל 0.7 x 50 ס"מ עם טווח הפרדה של 0.7-10 מגה דלתונים (MDa) בשווי PBS. הוסף את הליפוזומים והפעל כמו בשלב 1.6. לשברים המכילים ליפוזומים תהיה העברת אור מופחתת בטווח של 250-400 ננומטר.
8. אחסנו את הליפוזומים בטמפרטורה של 4°C ואל תקפאו.

4. שטף סידן לניטור הפעלת תאי B על ידי ליפוזומים אנטיגניים

1. המתת עכברים על ידי פחמן דו חמצני (CO₂) או מנת יתר של איזופלורן, על פי נהלי הפעלה סטנדרטיים מוסדיים. לאשר המתת חסד של עכברים על ידי נקע צוואר הרחם.
2. לעקר את כלי הניתוח ואת פגר העכברים באמצעות 70% אתנול. יש להשתמש במלקחיים קשתית מעוקלות באורך 10 ס"מ, קצה 0.8 מ"מ, כדי להפריד בין העור המכסה את חלל החזה לבין כלוב הצלעות. השתמש במספריים ישרים באורך 10 ס"מ כדי לבצע חתך דיסטלי עם חתך דו צדדי.
3. השתמש במלקחיים קשתית מעוקלת ובמספריים לניתוח כדי לחלץ את הטחול מחלל הבטן. הסר רקמת שומן המקיפה את הטחול ולאחר מכן הנח אותה בצינור חרוטי פוליסטירן 15 מ"ל מלא בתווך RPMI1640 המכיל 1% סרום עגל עוברי (FCS), ופניצילין-סטרפטומיצין.
4. מעבירים טחול ומדיה על גבי מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר המותקנת על צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. בעזרת קצה הגומי של בוכנה מזרק 3 מ"ל, למחוץ בעדינות את הטחול. שטפו את מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר עם התקשורת. חזור על תהליך זה עד שנשארת רק רקמת שומן במסננת התאים של 40 מיקרומטר. שטפו את המסננת עם 3-5 מ"ל של מדיה כדי להגביר את התאוששות התא.
5. הומוגנט תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף 10 מ"ל של חיץ ליזיס RBC 1x לכדור. פיפטה למעלה ולמטה, להשאיר 2-3 דקות ב RT, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
6. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הטחול המדולדל בכדוריות הדם האדומות ב-10 מ"ל של מדיה. קבע את מספר התאים הכולל באמצעות המוציטומטר או התקן ספירת תאים אחר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר לעיל.
   הערה: הריכוז הסופי האידיאלי הדרוש להעמסת טחול Indo-1 הוא 10-20 x 10⁶ תאים/מ"ל, אך ניתן להשתמש בריכוז נמוך יותר של תאים.
7. השהה מחדש טחול ב 15 x 10⁶ תאים / מ"ל במאגר העמסת שטף סידן (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 בינוני המכיל 1% FCS, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1mM מגנזיום כלורי (MgCl₂), 1mM אתילן גליקול-ביס(β-aminoethyl אתר)-N, N,N', N'-חומצה טטראצטית (EGTA), ו 5% פניצילין-סטרפטומיצין). הוסף 1.5 מיקרומטר Indo-1 מתמיסת מלאי DMSO של 1 mM, והפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב. יש להגן מפני אור, ולדגור על תאים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
8. לאחר הדגירה של 30 דקות, הוסיפו פי 5 יותר ממאגר העמסת שטף הסידן. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות ב RT.
9. עבור gating על תאי B, לצבוע תאים עם 1:200 נגד עכבר CD5-PE ו 1:200 נגד עכבר 1:200 B220-PE / Cy7 ב 0.5 מ"ל של חיץ טעינה ב 4 ° C במשך 20 דקות, מוגן מפני אור.
10. שטפו את הטחול במאגר העמסת שטף סידן ובצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 7 דקות ב-RT. השהה מחדש תאים ב-10-20 x 10⁶ תאים/מ"ל במאגר זרם סידן (תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 1% FCS, 1 mM MgCl₂ ו-1 mM סידן כלורי (CaCl₂)). יש לאחסן על קרח, מוגן מפני אור עד שהוא מוכן לפעול על ציטומטר הזרימה.
11. הגדר ציטומטריית זרימה עם בקרות כתמים בודדים ולא מוכתמים לפיצוי.
    1. הפעילו את התאים המוכתמים כדי לסדר את השערים כראוי (ראו איור 1A). הגדרת תרשים Indo-1 (סגול) לעומת Indo-1 (כחול), התאם את המתחים בתעלות Indo-1 כדי למקם את צביעת התאים בשיפוע של 45-60° כדי למקסם את האות: יחס רעש של Indo-1 סגול: שינוי כחול ביחס בעקבות גירוי תאי B.
       הערה: יש לוודא שהמתחים אינם גבוהים מדי, כך שאחוז ניכר מהתאים (>5%) נמצאים כנגד החלק העליון של העלילה.
    2. צרו שער אלכסוני העוטף את החלק השמאלי העליון (סגול⁺כחול⁾ של העלילה, כך שללא גירוי <10% מהתאים נמצאים בשער, מה שאמור לעלות באופן אידיאלי ל->75% לאחר הגירוי.
12. הוסף 0.5 מ"ל של תאים לצינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל (צינור מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות (FACS) וחמם את התאים ל -37 ° C למשך 3-5 דקות באמבט מים. הניחו את צינור ה-FACS בתא עטוף מים בטמפרטורה של 37°C המחובר לאמבט מים במחזור מחדש.
    1. הפעל את הצינור במעטפת המים על ציטומטר הזרימה והתחל ברכישה, מבלי לאחסן את הנתונים, בסביבות 5,000-10,000 אירועים לשנייה. לאחר שהתאים התייצבו (15-30 שניות), התחל באיסוף נתונים ואסוף נתונים במשך 10 שניות לפחות כדי לבסס את הרקע.
    2. בסימן 10 נזלת, הסר במהירות את הצינור מציטומטר הזרימה, הוסף את הגירוי (5-50 מיקרומטר ליפוזומים אנטיגניים ב 2-20 מיקרוליטר), דופק מערבולת, והחזיר את צינור FACS אל ציטומטר הזרימה. שמור על איסוף נתונים ואחסונם במהלך זמן זה ואסוף נתונים למשך 3-5 דקות.
13. נתח נתונים בתוכנת ניתוח מתאימה תחת פונקציות הקינטיקה.

טבלה 1: חישובים ליצירת ליפוזום בריכוז שומנים כולל של 1.25 מיקרומטר.דוגמה לטבלת חישוב עבור ליפוזומים של פרגמנט IgM F(ab) נגד עכבר

.

מ"ו	790	387	2900	3000	48000
	DSPC	כולסטרול	PEG-DSPE	עודף PEG-DSPE	aIgM-PEG-DSPE	סך
יחס מולארי	57	38	3.9	1	0.1	100.00
מסה (מ"ג)	0.56	0.18	0.14	0.04	0.06	0.98
ממול	0.71	0.47	0.05	0.01	0.00	1.25
מ"ל	112.50	45.93	70.64	0.00	525.97	755.03
			Conc. (מ"ג / מ"ל)
		DSPC	5
		כולסטרול	4
		PEG-DSPE	2
		aIgM-PEG-DSPE	0.114

תוצאות

איור 1: אסטרטגיית גטינג מייצגת, תוצאות שטף סידן וניתוח.(A) התאים נותחו באמצעות אסטרטגיית ה-gating הבאה: לימפוציטים חיים (FSC-A לעומת SSC-A), תאים בודדים (FSC-W לעומת SSC-W) ותאי B (B220⁺CD5^-). (B) תגובת השטף Indo-1/Ca²⁺ (סגול לעומת כחול) של תאי B. מוצג שטף הסידן עבור ליפוזומים אנטי-IgM Fab fragment ואנטי-IgM...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דגם 2110 אספן שברים	BioRad	7318122
כולסטרול	סיגמא	C8667	ציון סיגמא 99%
SPDP	תרמו פישר סיינטיפיק	21857
DSPC	אוונטי	850365
DSPE-PEG 18:0	אוונטי	880120
DSPE-PEG מלימיד	אוונטי	880126
מכבש	אוונטי	610000	מזרק 1 מ"ל עם מחזיק/בלוק חימום
מסננים 0.1 מיקרומטר	אוונטי	610005
מסננים 0.8 מיקרומטר	אוונטי	610009
תמיכה במסנן 10 מ"מ	אוונטי	6100014
בקבוק תחתון עגול מזכוכית	סיגמא	Z100633
פקקי מחזור	תרמו פישר סיינטיפיק	P-301398
אבובים	תרמו פישר סיינטיפיק	P-198194
מנעול Leur	תרמו פישר סיינטיפיק	K4201634503
Sephadex G50 חרוזים	GE מדעי החיים	17004201
Sephadex G100 חרוזים	GE מדעי החיים	17006001
חום סרום עגל עובר מומת	תרמו פישר סיינטיפיק	10082147
HEPES (1M)	תרמו פישר סיינטיפיק	15630080
EGTA	סיגמא	E3889
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122
1x RBC lysis Buffer	תרמו פישר סיינטיפיק	00-4333-57
הודו-1	Invitrogen	I1203
CD5-PE	ביולג'נד	100608
B220-PE-Cy7	ביולג'נד	103222
HBSS	תרמו פישר סיינטיפיק	14170112	ללא סידן ומגנזיום
MgCl2	סיגמא	M8266
CaCl2	סיגמא	C4901
IgM נגד עכבר Fab	ג'קסון מחקר חיסוני	115-007-020
F(ab')2 IgM נגד עכבר	ג'קסון מחקר חיסוני	115-006-020