תרבית חיידקים מסננת ריכוז חלבונים באמצעות מכשיר אולטרה-סינון

תקציר

מקור: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. J. Vis. Exp. (183) (2022)

סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של חלבוני סינון תרבית חיידקים, הכוללים שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות, באמצעות אולטרה-סינון. השלפוחיות החוץ תאיות המרוכזות משמשות כסמנים אבחוניים לגילוי מחלות.

פרוטוקול

1. הכנת תרכיז שלפוחית חוץ-תאית גולמית מסוג Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

הערה: להליכים מפורטים על טיפוח Mtb והכנת חלבון תסנין תרבית (CFP). מומלץ שמצע תרבית חיידקים יהיה נקי מתוספי גדילה עם רכיבים המכילים EV או חלבונים, כגון אלבומין אולאי דקסטרוז קטלאז (OADC), ודטרגנטים כגון Tween. כמו כן, מומלץ לבדוק את איכות תרבית החיידקים ואת CFP שנקצר כדי להבטיח מוות תאי וליזיס מוגבלים.

1. הכן מסנן צנטריפוגלי בעל חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO) (ראה טבלת חומרים) על-ידי הוספת קיבולת נפח מלאה של מלח חוצץ פוספט (1x PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-2,800 x גרם ב-4°C.
   הערה:אם אני משתמש בפילטר ללא נפח עצירה מת, יש להקפיד שנפח הדגימה לא יקטן מתחת לרמת המסנן, וכתוצאה מכך המסנן יתייבש לחלוטין במהלך הצנטריפוגה.
2. יש להשליך את הזרימה ואת כל PBS שנותרו לפני מילוי תא הדגימה ב- Mtb CFP לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב-2,800 x גרם ב-4°C עד שהנפח מצטמצם לנפח המינימלי של התקן האולטרה-סינון. חזור על הפעולה לפי הצורך, והוסף CFP נוסף ליחידה עד שכל הדגימה תצומצם במידה מספקת.
   הערה: שמור חלק מחומר הזרימה של 100 kDa (100F) לצורך הסמכה במורד הזרם, אם תרצה בכך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
3. הוסף PBS 1x ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת המכשיר הכוללת. הפחת את עוצמת הקול כמתואר ב- 1.2. חזור על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת חיץ.
4. שחזר את ה- CFP המרוכז של 100 kDa (100R) בהתאם למפרט התקן האולטרה-סינון (ראה טבלת חומרים). לאחר שחזור ה-100R, שטפו את הפילטר בנפח מינימלי של 1x PBS לפחות שלוש פעמים, ואגרו את השטיפה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות.
5. כמת את החומר 100R עם בדיקה בי-כוניצ'ונית (BCA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). כדי לבצע את הבדיקה, השתמש במספר דילולים של דגימות 1:2, 1:5 ו- 1:10 ב- PBS. בדוק את הדגימה ב- triplicate.
   הערה: שמור חלק מחומר 100R להסמכה במורד הזרם, אם תרצה בכך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אספן שברים אוטומטי	מדע IZON	AFC-V1-דולר
Centricon Plus - מסנן צנטריפוגלי 70, חיתוך 100 kDa	מיליפור סיגמא	UFC710008	התקן אולטרה-סינון המשמש בשלב 1.1
מלח חוצץ פוספט, 1X ללא סידן ומגנזיום	קורנינג	21-040-CV
קרום ניטרוצלולוז, גליל, 0.2 מיקרומטר	BioRad	1620112