1. הכנת תרכיז Mtb EV גולמי
הערה: להליכים מפורטים על גידול Mtb והכנת חלבון תסנין תרבית (CFP), ראה הפניות. מומלץ שמצע תרבית חיידקים יהיה נקי מתוספי גדילה עם רכיבים המכילים EV או חלבונים, כגון אלבומין אולאי דקסטרוז קטלאז (OADC), ודטרגנטים כגון Tween. כמו כן, מומלץ לבדוק את איכות תרבית החיידקים ואת CFP שנקצר כדי להבטיח מוות תאי וליזיס מוגבלים.
- הכן מסנן צנטריפוגלי בעל חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO) (ראה טבלת חומרים) על-ידי הוספת קיבולת נפח מלאה של מלח חוצץ פוספט (1x PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-2,800 x גרם ב-4°C.
הערה: אם משתמשים במסנן ללא נפח עצירה מתה, יש להקפיד שנפח הדגימה לא יקטן מתחת לרמת המסנן, וכתוצאה מכך המסנן יתייבש לחלוטין במהלך הצנטריפוגה.
- יש להשליך את הזרימה ואת כל PBS שנותרו לפני מילוי תא הדגימה ב- Mtb CFP לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב-2,800 x גרם ב-4°C עד שהנפח מצטמצם לנפח המינימלי של התקן האולטרה-סינון. חזור על הפעולה לפי הצורך, והוסף CFP נוסף ליחידה עד שכל הדגימה תצומצם במידה מספקת.
הערה: שמור חלק מחומר הזרימה של 100 kDa (100F) לצורך הסמכה במורד הזרם, אם תרצה בכך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הוסף PBS 1x ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת המכשיר הכוללת. הפחת את עוצמת הקול כמתואר ב- 1.2. חזור על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת חיץ.
- שחזר את ה- CFP המרוכז של 100 kDa (100R) בהתאם למפרט התקן האולטרה-סינון (ראה טבלת חומרים). לאחר שחזור ה-100R, שטפו את הפילטר בנפח מינימלי של 1x PBS לפחות שלוש פעמים, ואגרו את השטיפה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות.
- כמת את החומר 100R עם בדיקה בי-כוניצ'ונית (BCA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). כדי לבצע את הבדיקה, השתמש במספר דילולים של דגימות 1:2, 1:5 ו- 1:10 ב- PBS. בדוק את הדגימה ב- triplicate.
הערה: שמור חלק מחומר 100R להסמכה במורד הזרם, אם תרצה בכך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להעשרת כלי רכב חשמליים Mtb מ- CFP
הערה: ההליך הבא ספציפי לשימוש ב- 3 מ"ג של CFP Mtb 100R עם עמודת SEC ואספן שברים אוטומטי (AFC, ראה טבלת חומרים). ניתן להתאים אותו לריכוזי התחלה וסוגי עמודות אחרים על ידי ביצוע מפרטי היצרן. בנוסף, מומלץ למשתמשים לקרוא ולהבין את המדריך למשתמש של אספן השברים האוטומטי.
- אפשר לעמודת SEC להתאזן לטמפרטורת החדר.
- הפעל את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בגב יחידת ה-Tower וכוונן את ההגדרות עבור תא העומס, במידת הצורך, על-ידי לחיצה על SETUP במסך המגע של התפריט הראשי. יש לכייל את תא הטעינה רק בשימוש הראשון, לאחר כל עדכון תוכנה, ואם מבחינים בחוסר עקביות בנפחי איסוף השברים.
- מהמסך SETUP, ישר את הקרוסלה על-ידי בחירה באפשרות CAROUSEL > CALIBRATE. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה לתוך מגדל AFC, וכוונן את הקרוסלה כך שפיית הנוזל תהיה ישירות מעל מצב ההדחה על ידי לחיצה על הלחצנים - ו / או +.
- הסר את האותיות הגדולות מעמודת SEC המשווקת. החלק את עמודת SEC לתושבת העמודה המתאימה והתקן אותה בזהירות במגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו (RFID) בעמודה פונה ל- AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. הניחו את צינורות מוצא הפסולת במיכל איסוף.
- במסך SETUP, בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מ"ל על ידי לחיצה על הלחצנים - ו/או +. השאר את ההגדרה "עוצמת חיץ" כברירת המחדל של 2.7 מ"ל ולאחר מכן סגור את החלון "תזמון איסוף" על ידי לחיצה על X.
- בחר התחל אוסף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה באפשרות כן. עומס 13 צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.7 מ"ל מסומנים כאשר המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה.
- קדם את AFC על ידי בחירה באפשרות אישור, ולאחר מכן טען את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לרוקן את העמודה על-ידי הקשה על כן, והוסף אמצעי אחסון עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת ההדחה, קדם את AFC על ידי לחיצה על אישור.
- הניחו את מכסה הקרוסלה מעל ה-AFC ולחצו על OK. הכן נפח עמודה אחד של PBS מסונן 0.2 מיקרומטר. השתמש פיפטה כדי להסיר מאגר עודף מהעמודה.
- הביאו דגימה של 3 מ"ג של 100R כפי שכומתה בשלב 1.5 עד 500 מיקרוליטר עם PBS אחד. הוסף את הדגימה של 3 מ"ג לראש העמודה. הקדמו את ה-AFC ואפשרו לדגימה לרוץ לתוך הפריט. לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את PBS שהוכן בשלב 2.6 למאגר.
- נטר את הפעלת ה- AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את נפח הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר סיום הריצה והקרוסלה חוזרת למצב פסולת, הסר את המכסה והסר את צינורות השבר מהקרוסלה. אחסנו את השברים בטמפרטורה של 4°C לפני הכימות (שלב 3) וההסמכה (שלב 4).
- אם יש לעשות שימוש חוזר בעמודה, בחר באפשרות לנקות את העמודה על-ידי הקשה על כן; אחרת, הקש לא. בצע את ההוראות ב- AFC.
הערה: לאחר ששטף את העמודה ומאגר האחסון נגמר, ניתן להסיר, לסגור ולאחסן אותה ב- 4°C.
