1. הכנת נבגי אספרגילוס להזרקה
- מתרחיף נבג אספרגילוס, חשב את הנפח הדרוש לקבלת 1 x 106 נבגים. נפח צריך להיות 20-100 μL; אם לא, לייצר דילול 10x ב 0.01% (v/v) סטרילי Tween-20 (Tween-water; טבלת חומרים). לדוגמה, אם הנפח המחושב הוא 5 μL, לייצר דילול 10x ולהשתמש 50 μL של תמיסה מדוללת.
הערה: ניתן להכין שתי צלחות/זנים לאיסוף נבגים נוספים או כחילוף במקרה של זיהום.
- יש למרוח 1 x 106 נבגי אספרגילוס על צלחת אחת של מדיה מינימלית גלוקוז (GMM) (טבלת חומרים) עם מפזר חד פעמי סטרילי בצורת L בארון בטיחות ביולוגית. יש להימנע מהתפשטות לשולי הצלחת. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-4 ימים, כאשר הצלחת פונה כלפי מטה.
- ביום האיסוף, הביאו לארון הבטיחות הביולוגית שפופרות חרוטיות סטריליות ו-50 מ"ל חרוטיות (שתיים לכל זן), בקבוקים טריים של מי טווין סטריליים (אחד לכל זן) ומפיצים חד-פעמיים סטריליים בצורת L.
הערה: Miracloth ניתן לחתוך ~ 8 ב x 6 בחתיכות, עטוף בנייר כסף, autoclaved כדי לעקר.
- מניחים חתיכה אחת של בד miracloth בכל צינור חרוטי 50 מ"ל מסומן ומכסה מחדש. הוציאו את חבילת הבד המופלאה שנותרה ממכסה המנוע.
- הכניסו צלחות לארון הבטיחות הביולוגית. פתחו צלחת אחת, ואז שפכו את מי הטווין על החלק העליון כדי לכסות כשלושת רבעי הצלחת.
- בעזרת מפזר חד פעמי בצורת L, מגרדים בעדינות את פני השטח של תרבית הפטריות בתנועה קדימה ואחורה, תוך שימוש ביד השנייה כדי לסובב את הצלחת. מגרדים עד שכמעט כל הנבגים עוברים הומוגניות למי הטווין.
הערה: בשל הידרופוביות גבוהה, נבגים יכולים ליצור "נשיפות" כאשר מוסיפים מים או במהלך גירוד. יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע זיהום של צינורות או צלחות בקרבת מקום. מומלץ להחליף כפפות ולנגב את פני השטח עם 70% אתנול בין מיצוי זנים שונים.
- קח צינור חרוטי אחד 50 מ"ל והסר את חתיכת miracloth. קפלו אותו לשניים והפכו אותו לפילטר המוכנס בחלק העליון של הצינור החרוטי 50 מ"ל.
- יוצקים את הומוגנט פטרייתי מן הצלחת על miracloth לתוך הצינור.
הערה: אם מכינים שתי צלחות מזן אחד, מגרדים את שתי הצלחות ויוצקים אותן לאותו צינור חרוט.
- יוצקים מים Tween להביא את הנפח הכולל בצינור חרוטי ל 50 מ"ל.
- יש לסחור במהירות של 900 x גרם למשך 10 דקות. יש להקפיד להשתמש בפקקים מונעי אירוסוליזציה בצנטריפוגה.
- יוצקים את supernatant לתוך ~ 10% אקונומיקה תמיסת לטהרה. יוצקים 50 מ"ל של מלח סטרילי 1x פוספט חוצץ (PBS) לתוך הצינור החרוט, ולאחר מכן מערבלים או לנער כדי להשעות מחדש את הכדור.
- סובבים שוב ב 900 x גרם במשך 10 דקות. יוצקים את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 5 מ"ל של סטרילי 1x PBS. מסננים דרך פיסת בד פלא טרייה לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל.
- בצע דילולים סדרתיים פי 10 (10x, 100x, 1000x) של הומוגנט פטרייתי בצינורות צנטריפוגות 1.7 מ"ל (למשל, עבור תמיסה 10x, לערבב 100 μL של הומוגנט פטרייתי עם 900 μL של מים טווין).
- בחר את הדילול הראשון שבו הנבגים אינם נראים כאשר הוא נפלט לתוך Tween-water ולהשתמש דילול זה כדי לספור את מספר הנבגים באמצעות hemocytometer.
- חשב את ריכוז הנבגים בהומוגנט הפטרייתי המוכן (תרחיף מים) באמצעות הנוסחה הבאה:
ריכוז (נבגים/מ"ל) = מספר הנבגים באמצע 25 קופסאות x מקדם דילול x 104
- הכינו מלאי של 1 מ"ל של 1.5 x 108 נבגים/מ"ל ב-PBS סטרילי 1x בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל. הכנת נבגים זו יכולה להיות מאוחסנת ב 4 ° C במשך ~ 4 שבועות.
- לפני השימוש בזריקות, יש לערבב 20 μL של הכנת הנבג עם 10 μL של 1% פנול סטרילי אדום בצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל כדי להשיג ריכוז נבגים סופי של 1 x 108 נבגים / מ"ל. מערבולת ביסודיות לפני ההזרקה.
הערה: תמיסה אדומה פנול 1% צריכה להיות מעוקרת בסינון ומאוחסנת ב- aliquots.
- להזרקת דמה, יש לערבב 20 μL של 1x PBS עם 10 μL של פנול סטרילי אדום 1%.
2. הכנת צלחות אגר להזרקה
- מכינים 2% אגרוז בתווך E3 וממיסים במיקרוגל.
- יוצקים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ (~ 25 מ"ל לצלחת), מערבלים כדי לכסות את הצלחת באופן שווה, ומניחים להתקרר.
- עוטפים את הצלחת בסרט פרפין ומאחסנים הפוך ב-4°C.
- לפני ההזרקה, הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר (RT).
- יש לשפוך ~1 מ"ל של אלבומין סרום בקר 2% מעוקר במסנן (BSA) על הצלחת, להטות את הצלחת כך שתמרח ולכסות את כל החלק התחתון, ולשטוף עם E3.
הערה: תמיסת 2% BSA ניתנת לסינון מעוקר ומאוחסנת כ-1 מ"ל aliquots בטמפרטורה של -20°C. טיפול מקדים של 2% BSA מונע מהזחלים להידבק לפני השטח של האגרוז.
- יוצקים E3 עם טריקאין חוצץ על הצלחת ומניחים לו לשבת עד ההזרקה.
3. מיקרו-הזרקה לחדר האחורי של זברי זברה
- זחלים dechorionate ידנית עם מלקחיים ב 2 dpf בצלחת פטרי.
הערה: Dechorionation ניתן לבצע בכל עת מ 1.5 dpf עד זמן ההזרקה.
- הוציאו כמה שיותר E3 מצלחת הפטרי והוסיפו טריקאין חוצץ של 300 מיקרוגרם/מ"ל ב-E3 כדי להרדים את הזחלים.
הערה: ניתן להכין ולאחסן תמיסת מלאי של טריקאין חוצץ 4 מ"ג/מ"ל ב-E3 בטמפרטורה של 4°C. פתרון העבודה יכול להתבצע על ידי דילול 4 מ"ל של פתרון המניות עד 50 מ"ל עם E3.
- השתמש במערך מיקרו-הזרקה המסופק עם מזרק הלחץ, יחידת לחץ אחורית, מתג רגל, מחזיק מיקרופיפטה, מיקרומניפולטור ומעמד וצלחת מגנטיים, כולם מחוברים למקור אוויר דחוס (טבלה של חומרים).
- פתח את שסתום האוויר הדחוס והפעל את המיקרו-מזרק. הגדר את הלחץ ל~25 PSI, משך הדופק ל- 60 אלפיות השנייה ויחידת הלחץ האחורית ל- 1 פאונד לאינץ' מרובע (PSI).
- טען מחט מיקרו-הזרקה באמצעות קצה פיפטה microloader (טבלה של חומרים) עם כ 3-5 μL של PBS מוכן או תרחיף נבג עם פנול אדום. הרכיבו את המחט על המיקרומניפולטור.
הערה: מחטי מיקרו-הזרקה יכולות להיות מוכנות כפי שתואר קודם לכן. המיקרוסקופ הסטריאופוני המשמש למיקרו-הזרקות צריך להיות בעל רטיקל עינית כדי לכייל את מחט המיקרו-הזרקה. יש לכייל את הרשתית במיקרומטר שלב, ולקבוע את אורך סולם הרשתית (μm). קוטר טיפת תרחיף הנבגים הנפלטת מהמחט נמדד בהתאם למספר הגיבובים (של הרשתית) החופפים לטיפה.
- מקם את המיקרומניפולטור כך שקצה המחט יהיה גלוי בהגדלה הנמוכה ביותר מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. התקרבו להגדלה פי 4, תוך שמירה על המחט גלויה.
- בעזרת מלקחיים חדים, חותכים את קצה המחט. לחץ על דוושת ההזרקה כדי לדמיין את גודל הטיפה שיוצאת. המשך לחתוך בחזרה עד ~ 3 nL של תרחיף נבג מוזרק (כאן, זה חמישה hashes).
- הזיזו את המיקרומניפולטור והמחט מהדרך כדי למנוע פגיעה בטעות במחט בזמן שהזחלים מסודרים על צלחת ההזרקה.
- יוצקים E3-Tricaine מצלחת ההזרקה, ואז מעבירים ~ 24 זחלים מורדמים לצלחת ההזרקה עם E3 קטן ככל האפשר באמצעות פיפט העברה.
- בעזרת כלי קטן למניפולציה של זחלי דגי זברה (כלומר, כלי לולאת שיער או כלי ריסים), סדרו את הזחלים לפי הכיוון אליו הם פונים. באופן ספציפי, מקם את כל הפונים ימינה בשורה אחת, ואת כולם פונים שמאלה בשורה מתחת.
הערה: סידור זה קשה אם יש יותר מדי נוזלים על הצלחת, שכן הזחלים "יצופו" ממקומם. עם זאת, מעט מדי נוזלים הוא גם בעייתי אם הזריקות לוקחות זמן רב, שכן הזחלים יכולים להתייבש או שההרדמה מתפוגגת. לכן, יש להקדיש תשומת לב זהירה לכמות הנוזלים על הצלחת לאורך כל תהליך המיקרו-הזרקה.
- כוונן את זום המיקרוסקופ להגדלה הנמוכה ביותר. החזירו את המיקרומניפולטור וסדרו אותו כך שהמחט תהיה קרובה לזחלים, בזווית ~30°-60°, באמצע שדה הראייה.
- התקרב להגדלה הגבוהה ביותר והשתמש בידיות כוונון עדינות כדי לכוונן עוד יותר את מיקום המחט. ודא כי ~ 30-70 נבגים יוצאים מהמחט על ידי הזרקת תרחיף הנבג לתוך הנוזל על הצלחת ליד הזחלים. התאם את הזמן והלחץ על הגדרת ההזרקה, במידת הצורך.
הערה: יש לחזור על בדיקה זו כל חמישה עד שישה זחלים, שכן מספר הנבגים היוצאים מהמחט יכול לעלות או לרדת עם הזמן.
- החל מהשורה שבה הזחלים פונים לכיוון המחט, הזיזו את הצלחת כך שהמחט תהיה ישירות מעל ותמוקם ליד הזחלים הראשונים.
- הזזת המחט עם המיקרומניפולטור, הכנס את המחט דרך הרקמה סביב השלפוחית האופטית כדי לחדור לחדר המוח האחורי. הזז את הצלחת ביד השנייה לפי הצורך כדי לקבל את הכיוון הנכון של הזחל עם זווית המחט.
- ודא חזותית שקצה המחט נמצא במרכז החדר האחורי, לחץ על דוושת כף הרגל כדי להזריק נבגים, ומשוך בעדינות את המחט.
הערה: הצבע האדום פנול צריך להישאר בעיקר בתוך החדר האחורי. כמות קטנה עשויה להיכנס למוח האמצעי, אבל היא לא אמורה להגיע למוח הקדמי או מחוץ למוח. אם כן, הנפח המוזרק גדול מדי, ויש להפחית את הלחץ והזמן בהתאם, או לכייל מחט חדשה.
- נעים במורד הצלחת, מזריקים את כל הזחלים בשורה זו. לאחר מכן, סובבו את הצלחת והזריקו את כל הזחלים לשורה השנייה.
הערה: זחלים שהוזרקו ללא הצלחה או ניזוקו בטעות יכולים להיות מסומנים על ידי 1) הזרקה לתוך החלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או 2) גרירת הזחל מהשורה עם המחט.
- הזיזו שוב את המחט למעלה והחוצה מהדרך. התרחקו להגדלה נמוכה יותר במיקרוסקופ. הצבע האדום פנול עדיין צריך להיות גלוי במוח האחורי של כל זחל.
- ראשית, משכו משם עם כלי לולאת שיער ופיפטה למעלה כדי להיפטר מכל הזחלים עם זריקות לא מוצלחות. מעבירים את הזחלים הנותרים לצלחת פטרי חדשה על ידי שטיפתם מהצלחת עם E3 סטרילי טרי ופיפט העברה.
- חזור על הפעולה לפי הצורך עבור מספר מדגם הניסוי הסופי הרצוי.
- יש לשטוף את הזחלים לפחות פעמיים עם E3 ולהבטיח התאוששות מהרדמה.
- כדי לכמת הישרדות ללא כל טיפול נוסף, באמצעות פיפטה העברה, להעביר את הזחלים לתוך צלחת 96 באר (1 זחל לכל באר) ב E3.
4. הקמת מספרי נבגים מוזרקים וברי קיימא
- מיד לאחר ההזרקה, באמצעות פיפטת העברה, בוחרים באופן אקראי כשמונה מהזחלים המוזרקים ומעבירים אותם לצינורות צנטריפוגות בנפח 1.7 מ"ל (זחל אחד לכל צינור).
- הרדימו זחלים עם טריקאין או על ידי הצבתם ב 4 °C למשך 0.5-2.0 שעות.
- הכינו 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל אמפיצילין ו-0.5 מ"ג/מ"ל קנמיצין תמיסות אנטיביוטיות ב-PBS סטרילי 1x. ניתן לאחסן את תמיסת השאריות בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש בה מאוחר יותר.
הערה: תמיסות מלאי של אמפיצילין ב 100 מ"ג / מ"ל וקנמיצין ב 50 מ"ג / מ"ל ניתן להכין מראש, לסנן ולאחסן ב aliquots ב -20 ° C. לדלל אלה 100x ב 1x PBS כדי לקבל את פתרון העבודה.
- באמצעות פיפטה, להסיר נוזל רב ככל האפשר מן הצינור צנטריפוגה, משאיר את הזחל מאחור, ולהוסיף 90 μL של PBS 1x עם אנטיביוטיקה.
הערה: אנטיביוטיקה משמשת למניעת צמיחת חיידקים בצלחות GMM שעלולות להפריע לספירה של מושבות אספרגילוס.
- הומוגניזציה של הזחלים בליזר רקמה במהירות של 1,800 תנודות לדקה (30 הרץ) למשך 6 דקות. סחרור כלפי מטה במהירות של 17,000 x גרם למשך 30 שניות.
- תווית צלחות GMM (צלחת אחת לכל זחלים הומוגניים). בעזרת מבער Bunsen ליצירת סביבה סטרילית, מחלקים את התרחיף ההומוגני מצינור אחד לאמצע צלחת GMM, ואז מורחים באמצעות מפזר חד פעמי בצורת L. הימנעו מפיזור ההומוגנט כנגד השפה.
- לדגור את הלוחות הפוך ב 37 ° C במשך 2-3 ימים ולספור את מספר המושבות שנוצרו, יחידת יצירת מושבה (CFU).
- כדי למדוד את מספר הנבגים החיים בתקופת ההדבקה, יש לאסוף זחלים מלוחות 96 הקידוחים 1-7 ימים לאחר ההזרקה (dpi) ולהעבירם לצינורות צנטריפוגות. המתת חסד והומוגניזציה של הזחלים כדי להתפשט על לוחות GMM כמתואר בשלבים 4.1-4.5.
5. טיפול תרופתי בזחלים מוזרקים
- לאחר סעיף 4, פצלו את הזחלים המוזרקים הנותרים לשתי צלחות בקוטר 3.5 מ"מ: אחת לטיפול התרופתי ואחת לביקורת. השתמש בכ -24 זחלים נגועים לכל מצב.
הערה: את הכלים בקוטר 3.5 מ"מ ניתן לטפל בחלב יבש 2% ללא שומן במים, לשטוף, לייבש באוויר ולאחסן ב-RT מראש. ציפוי בחלב ימנע מהזחלים להידבק לפלסטיק.
- הכינו את תמיסת התרופה הרצויה ואת הרכב ב-E3 ללא מתילן כחול בצינורות חרוטיים בהתאם לריכוז הסופי הנדרש, ואז ערבבו היטב. לדוגמה, כדי לפקח על הישרדותם של זחלים שנחשפו לדקסמטזון, השתמש ב-24 זחלים (משוכפלים) עבור דקסמתזון ו-24 עבור בקרת רכב, כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO). הכן 5 מ"ל של פתרון התרופה בריכוז הנדרש. כאן נעשה שימוש ב-5 מ"ל של 0.1% DMSO ו-10 מיקרומטר דקסמתזון, ו-24 זחלים/מצב הועברו ל~200 מיקרוליטר של הרכב/תמיסת התרופה/הזחלים.
- מוציאים כמה שיותר נוזלים מצלחת אחת עם פיפטת העברה ומוסיפים E3 מעורבב מראש המכיל בקרת רכב. חזור על הפעולה עם E3 מעורבב מראש המכיל את הטיפול המעניין עבור המנה השנייה.
- בעזרת פיפטה מעבירים את הזחלים לצלחת בת 96 בארות (זחל אחד לכל באר). עקוב אחר הישרדותם של זחלים מוזרקים שנחשפו לרכב או לתרופה במשך 7 ימים.
הערה: התרופה יכולה להיות מיושמת אך ורק ביום ההדבקה ונשמרת על הזחלים במשך כל הניסוי או ניתן לרענן מדי יום.
6. הדמיה יומית של זחלים נגועים באמצעות מכשיר הפציעה והלכידה של דגי הזברה לגדילה והדמיה (zWEDGI)
- ודא כי הזחלים מטופלים עם 100 מיקרומטר N-phenylthiourea (PTU) ב 24 hpf כדי למנוע פיגמנטציה וכי PTU נשמר על הזחלים במשך כל הניסוי.
הערה: PTU ב 75-100 מיקרומטר מונע פיגמנטציה של הזחלים ללא כל פגמים התפתחותיים גסים. עם זאת, PTU יכול להפריע לתהליכים ביולוגיים מסוימים, והחוקרים צריכים לקבוע מראש אם התרופה עשויה להשפיע על תהליכים כלשהם הנחקרים.
- להדביק זחלים טרנסגניים עם אוכלוסיות תאים מסומנות בעלות עניין ב 2 dpf עם נבגי אספרגילוס שהונדסו לבטא חלבון פלואורסצנטי, כמתואר בסעיף 3. לאחר מכן, העבירו זחלים נגועים לבארות של צלחת 48 בארות בכ-500 μL/באר של E3 ללא methylene blue.
הערה: צלחת 48 בארות משמשת כאן מכיוון שקל יותר להעביר זחלים פנימה והחוצה במהלך הדמיה יומית חוזרת.
- ביום ההדמיה, הכינו שתי צלחות פטרי בקוטר 3.5 מ"מ: אחת עם 100 מיקרומטר PTU ואחת עם E3-טריקאין.
- הוסף E3-tricaine לתוך התאים של מכשיר zWEDGI. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, הסירו בועות אוויר מהתאים ומהתעלה המרסנת באמצעות מיקרופיפטה P100. הסר את כל עודף E3-tricaine, אז זה רק בחדרים.
- פיפטה מעלה זחל אחד מהצלחת באמצעות פיפטת העברה. אם משתמשים בנוזל רב כדי להסיר אותו, פיפטה אותו לתוך צלחת 3.5 מ"מ המכילה E3-PTU. לאחר מכן, פיפטה שוב, באמצעות נוזל קטן ככל האפשר, ולהעביר לתוך E3-tricaine.
- המתן ~30 שניות להרדמה, ואז העבר לתא ההעמסה של מכשיר הפציעה והלכידה (למשל, zWEDGI).
- מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, מקם את הזחל. השתמש במיקרופיפטה P100 כדי להסיר E3-tricaine מתא הפציעה ולשחרר אותו לתוך תא ההעמסה כדי להזיז את זנב הזחל לתוך תעלת ההגבלה. ודא שהזחל ממוקם בצד הצידי, הגבי או הדורסולטרלי שלו, כך שניתן יהיה לצלם את המוח האחורי באמצעות עדשה אובייקטיבית הפוכה.
- תמונה זחל עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
- לאחר ההדמיה, עם פיפטה P100, שחררו E3-טריקאין לתוך תא הפציעה כדי לדחוף את הזחל מתעלת הריסון לתוך תא ההעמסה.
- בעזרת פיפטת העברה, הרימו את הזחל והעבירו אותו חזרה לצלחת הפטרי עם E3-Tricaine. בעזרת כמה שפחות נוזלים, העבירו אותם לצלחת הפטרי עם E3-PTU. יש לשטוף ב-PTU ולהעביר בחזרה לצלחת בעלת 48 הבארות.
