בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

תקציר

מקור: Chua, J., et al. Opsono-Adherence Assay להערכת נוגדנים פונקציונליים בפיתוח חיסונים נגד Bacillus anthracis ופתוגנים עטופים אחרים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים בדיקת היצמדות אופסונו-לבחינת האינטראקציה בין חיידקים שעברו אופסונציה לבין תאי מערכת החיסון. חיידקים המסומנים בפלואורסצנטית, מטופלים בסרום בדיקה המכיל נוגדנים נגד קפסולות, מודגרים עם מקרופאגים. לאחר צביעת המקרופאגים בפלואורסצנטיות, החיידקים המחוברים על פני המקרופאגים נצפים תחת מיקרוסקופ לצורך הדמיה.

פרוטוקול

1. תרבית חיידקים ותכשירים

הערה: זן החיידקים המשמש בפרוטוקול זה הוא זן אלים עטוף, B. anthracis Ames. כל המניפולציות עם מין זה דורשות בטיחות ביולוגית מתאימה וסיווג ביטחוני ויש לבצע אותן בארון בטיחות ביולוגי Class II או Class III הממוקם במעבדה BSL-3. בצע את נהלי ההפעלה המוסדיים לעבודה BSL-3 ולשימוש בציוד מגן אישי בעת טיפול בחיידקים.

1. הכינו ציר עירוי לב למוח (BHI) על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ב-1 ליטר מים וכריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות. אחסנו את המרק בטמפרטורת הסביבה.
2. מכינים תמיסת ביקרבונט נתרן 8% במים ומעקרים באמצעות מזרק מסנן 0.20 מיקרומטר. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך יום אחד.
3. ערבבו 8 גרם ציר מזין, 3 גרם תמצית שמרים ו-15 גרם אגר ב-1 ליטר מים להכנת צלחות אגר NBY. Autoclave ב 121 ° C למשך 15 דקות. יוצקים לתוך כלי פטרי ומניחים להתמצק. יש לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן להכין צלחות אגר NBY עם או בלי סודיום ביקרבונט. תוספת של סודיום ביקרבונט מרק צלחות אגר גורם לצמיחה של מושבות ריריות המורכבות bacilliated עטוף. הריכוז הסופי של סודיום ביקרבונט הן במדיה נוזלית והן במדיה מוצקה הוא 0.8%.
4. הכינו ציר תרבית עבור B. anthracis על ידי ערבוב 50% מרק BHI אוטוקלאב, 40% FBS, ו 10% תמיסת סודיום ביקרבונט (v/v).
   הערה: ציר זה מיוצר כדי לייצר שרשראות קצרות של בצילוס עטוף.
5. הכינו צלחת מאסטר של B. anthracis על ידי פסים לבידוד על צלחת אגר NBY מציר נבגים יום אחד לפני תרבית במרק. לדגור ב 37 °C (77 °F).
6. לחסן 30 מ"ל של מרק תרבית בבקבוק מאוורר 250 מ"ל עם כמה מושבות של B. anthracis.
   הערה: יש צורך ביחס נפח-פני שטח ספציפי של מרק, כפי שצוין כאן, כדי לייצר בצילוס עטוף באופן מקסימלי.
7. נערו את תרבית המרק ב-125 סל"ד, 37°C עם 20%_CO2 ולחות למשך 18-24 שעות
   הערה: גידול B. anthracis בטמפרטורות גבוהות מ -37 °C עלול לעכב את ייצור הכמוסות.
8. השתמשו בכתמים שליליים בדיו הודי כדי להבטיח כימוס מספיק ושהבצילוס נמצא בשרשראות קצרות (1-5 בצילוס/שרשרת) לפני הקיבוע (ראה סעיף 2).
9. כדי לקבוע יחידות יוצרות מושבה (CFU), יש לדלל סדרתית 100 מיקרוליטר של תרבית ביחס 1:10 בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ודילול תרביות צלחות על לוחות אגר מדם כבשים. לדגור במשך 12-18 שעות ב 37 ° C. לספור CFUs ולקבוע את מספר החיידקים לכל מ"ל של תרבית.
   הערה: ספירה יכולה להתבצע גם באמצעות המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ לאחר שהחיידקים תוקנו. עם זאת, זה לא מומלץ כי bacilli קשה לראות תחת הגדלה נמוכה.
10. הוסף 16% paraformaldehyde (PF) לכל נפח תרבית חיידקים בריכוז סופי של 4% PF כדי לתקן את bacilli. יש להסעיר באיטיות על שייקר בטמפרטורת הסביבה למשך 7 ימים.
    הערה: שבעה ימי דגירה ב-4% PF מבוססים על נוהל הפעלה מוסדי סטנדרטי של מכון המחקר הרפואי של צבא ארצות הברית למחלות זיהומיות (USAMRIID) לקיבוע חיידקי צמחי.
11. כדי להסיר את הקיבוע ולבדוק סטריליות, יש לשטוף שלוש פעמים 4 מ"ל (10% נפח) של תרחיף חיידקי קבוע בצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות צנטריפוגה ב ≥3000 x גרם למשך 45 דקות ובאמצעות 30 מ"ל / שטיפה עם PBS. אחסן את הדגימה הנותרת ב- 4% PF ב- 4 ° C.
    הערה: לאחר כדור, גלולה חיידקית הוא רך בשל נוכחות של כמוסה. יש להקפיד לא להפריע לגלולה במהלך הכביסה. יש צורך להסיר את כל fixative כך שזה לא להפריע בדיקות הכדאיות. במידת הצורך, להגדיל את מספר שטיפות.
12. לבדיקת כדאיות, יש לחסן 40 מ"ל של מצע גידול חיידקים (למשל ציר BHI) ב-4 מ"ל תרחיף שטוף (≤ 10% מנפח הציר) ולדגור ב-37°C למשך 7 ימים. בדוק צפיפות אופטית של 600 ננומטר לפני ואחרי 7 ימים כדי למדוד עכירות.
13. לאחר 7 ימי דגירה בתרבית מרק, צלחת ≥100 מיקרוליטר ציר על צלחת אגר ודגרים עוד 7 ימים. אם לא רואים עלייה בעכירות ולא רואים גידול בצלחות, התרבית המקורית נחשבת סטרילית וניתן להעביר אותה למעבדת BSL-2.
    הערה: תוכנית הסוכנים הפדרלית קובעת כי B. anthracis בלתי פעיל יכול להיות מועבר רק ממעבדות BSL-3 לאחר הוכחת סטריליות מוחלטת של הדגימה. בדיקת כדאיות עבור B. anthracis בלתי פעיל מורכבת מגידול 10% מהדגימה במרק במשך 7 ימים ולאחר מכן תרבית על מדיום מוצק במשך 7 ימים נוספים. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות כדי לקבל אישור העברה לאחר קביעת סטריליות.         

2. צביעה שלילית ומיקרוסקופ אור לצפייה בשרשראות אנקפסולציה ובצילוס

1. יש לערבב תרחיף חיידקי 5 μL עם 2 μL דיו הודי בשקופית מיקרוסקופ. הניחו זכוכית כיסוי בעובי 1 או 1.5 מיקרומטר על גבי המתלה מבלי ליצור בועות.
   הערה: ניתן להשתמש בלק כדי לאטום את זכוכית הכיסוי על המגלשה.
2. התבונן בתרחיף החיידקי באמצעות עדשת אובייקטיבי שמן 40x עד 100x במיקרוסקופ אור. ודא כי bacillis הם עטוף על ידי התבוננות באזור של פינוי (כמוסה לא כולל דיו הודו) סביב כל חיידק וכי שרשראות bacilli קצרים.

3. FITC-תיוג של חיידקים

1. להמיס פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) בדימתיל סולפוקסיד בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
2. מדוד את נפח מלאי החיידקים הבלתי פעילים.
3. שטפו את המלאי פי 3 ב-PBS כדי להסיר את הקיבוע.
4. הוסף תמיסת FITC בריכוז סופי של 75 מיקרוגרם/מ"ל. לאט לאט להתסיס את התערובת במשך 18-24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. שלוש פעמים לשטוף את החיידקים על ידי גלולה ב ≥3000 x גרם, 45 דקות, ובאמצעות 30 מ"ל PBS / לשטוף כדי להסיר FITC עודף. יש לוודא שהגלולה הרכה אינה מופרעת במהלך הכביסה. השהה מחדש את הבצילוס ב- PBS באותו נפח התחלה.
6. Aliquot ולאחסן את bacilli microtubes ב -20 °C עד השימוש. אין להקפיא/להפשיר בצילוס מספר פעמים מכיוון שהבצילוס עלול לאבד את הכמוסה שלו.

4. אופסוניזציה חיידקית

1. יש לחמם כמות קטנה של סרה לבדיקה (מפרימטים לא אנושיים, NHPs) בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות בבלוק חום.
2. הפשירו ושטפו חיידקים המסומנים בתווית FITC עם PBS 2x על ידי כדוריות בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך 3-5 דקות. יש להשהות מחדש ב-PBS באותו נפח התחלה.
3. בצלחת תחתונה עגולה 96 באר (צלחת #2), סרה בדיקה מדוללת סדרתית בתווך התא. בעוד צלחת תחתונה עגולה 96 באר (צלחת #3), להוסיף 10 μL של sera בדיקה מדולל לתוך כל באר.
   הערה: בכל צלחת נכללו PBS וסרה קוף רגיל במקום סרה בדיקה מדוללת כביקורת שלילית. בחרנו גם בסרום בדיקה אחד כביקורת חיובית כדי ליצור עקומה סטנדרטית כדי לנרמל את כל הבדיקות שנעשו בימים שונים. סרום בדיקת הבקרה החיובית נבחר באופן שרירותי מכיוון שהיה בשפע.
4. לצלחת #3, להוסיף 10 μL ארנב התינוק טרי reconstituted משלים.
   הערה: לאחר ההרכבה מחדש, השליכו את משלים הארנב התינוק שנותר; אין להקפיא ולהפשיר.
5. כדי צלחת #3, להוסיף את הנפח המתאים של bacilli מסומן FITC עבור ריבוי של זיהום של 1:20. לדוגמה, הוסף את אמצעי האחסון המכיל 5 x 10⁴ x 20 bacilli עבור 5 x 10⁴ תאים. למעלה כל באר בצלחת #3 עם נפח מתאים של תא בינוני לסך הכל 105 μL.
   הערה: צלחת #1, המכילה תאים, מקבלת 100 μL של חיידקים opsonized עם 5 μL הנותרים כמו נפח ריק. בדקנו כל דילול של סרה הבדיקה בכפילות.
6. צלחת דגירה #3 ב 37 °C במשך 30 דקות בנוכחות 5% CO₂ עם לחות כדי opsonize bacilli.

5.בדיקת דבקות ותיוג פלואורסצנטי של תאי יונקים

1. יש לשמור על כל הריאגנטים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
2. מניחים צלחת #1, המכילה תאים דבקים, על בלוק חום של 37 מעלות צלזיוס.
3. השתמש pipettor רב ערוצי כדי להסיר את המדיום בילה מבארות במהירות להחליף אותו עם 100 μL של חיידקים opsonized מ צלחת #3. יש לוודא שלא נוצרו בועות בבארות במהלך הפיפט. דגירה צלחת #1 ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות במשך 30 דקות להידבקות.
4. שטפו כל באר 5x עם PBS 150 μL על גבי בלוק חום של 37°C כדי להסיר bacilli.
   הערה: יש להקפיד על כך שהתאים לא יתפזרו בטעות במהלך הכביסה.
5. לדלל 16% PF עם PBS 1:4 כדי ליצור 4% PF. תקן תאים עם 4% PF למשך שעה אחת על ידי הוספת 150 μL לכל באר. לשטוף תאים 2x עם PBS.
6. יש לערבב 2 μL HCS (סינון תוכן גבוה) כתם תאים כתום ב-PBS של 10 מ"ל. הוסף 150 μL של תמיסת צביעה זו לתאים קבועים ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
7. לשטוף בארות 2x עם PBS.
8. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד למיקרוסקופיה.

6. מיקרוסקופיה

הערה: באופן כללי, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי בתפוקה גבוהה יקל על הדמיה עבור OAA. אם מערכת אוטומטית אינה זמינה, ניתן לצלם תמונות ניאון של bacilli דבק באופן ידני. במחקר זה, בצילוס דבק ומונושכבות תאים צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss 700 עם ציוד מיוחד; המערכת שלנו הורכבה ממיקרוסקופ הפוך Zeiss Axio Observer Z1 המצויד בשלב אוטומטי, מודול מיקוד מוגדר, 40 x NA 0.6 objective, מצלמת Axio Cam HRc ותוכנת Zen 2012 (Blue Edition). התמונות המתקבלות הן תמונות שדה רחב, לא תמונות קונפוקליות. הפרוטוקול הבא מיועד כמערך מיקרוסקופ בסיסי המתאים למגוון מערכות מיקרוסקופיה אוטומטיות.

1. צלחת דגירה #1 בטמפרטורת הסביבה למשך 30 דקות. הפעל את המיקרוסקופ והציוד הנלווה.
   הערה: התאקלמות בטמפרטורת הסביבה מונעת היווצרות עיבוי על לוח הזכוכית במהלך ההדמיה. בנוסף, הוא מונע ביטול מיקוד עקב שינויי טמפרטורה.
2. הניחו את הצלחת על הבמה והתמקדו בתאים באמצעות שדה בהיר או ניגודיות פאזה.
3. בחר תבנית 96 באר כהגדרת הצלחת. בחר הגדרות ערוץ.
   הערה: שיא העירור ואורך גל הפליטה של FITC הוא 495/519 ננומטר; כתמי התאים הכתומים של HCS הם 556 ו-572 ננומטר. ניתן להשתמש בפלואורופורים אחרים בהתאם למסננים הזמינים במיקרוסקופ.
4. בחר הגדרה למצב אריח. ציין את מספר התמונות שיש לרכוש.
   הערה: פונקציית האריחים מאפשרת לכידה של מיקומים מרובים בבאר דגימה וניתן להגדיר אותה לקבלת תמונה באריחים או בפורמט אקראי. צילמנו 10 אזורים אקראיים לכל באר.
5. שנה את מצב הרכישה ל"שחור-לבן" או "מונוכרום" ובינינג ≥ 2x2.
   הערה: הגדרת הקישור מ- 1x1 ל- 2x2 או 4x4 תגדיל את מהירות המיקרוסקופ, אך גם תגרום לרזולוציה נמוכה יותר של התמונה. עבור OAA, מספיק להשתמש בהגדרות אלה מכיוון שהבדיקה מונה הן את המקרופאגים והן את החיידקים הדבקים.
6. הפעל את מודול המיקוד האוטומטי או המיקוד. ציין באיזו תדירות יש לבצע את פונקציית המיקוד האוטומטי. הפעל את פונקציית מחסנית Z, אם זמינה. ציין את מספר ערימות Z שילכדו את עובי החד-שכבה של התא ואת bacilli.
   הערה: מספר ערימות ה-Z שנבחרו יגדיל את זמן המיקרוסקופ, אך יבטיח צילום תמונה עם המיקוד הנכון בכל ערימת Z.
7. הקצו תיקיית קובץ לשמירת תמונות. הפעל את תוכנית ההדמיה האוטומטית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר (25 מ"מ, תאית מתחדשת)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	431222
מזרק 10 מ"ל (קצה Luer-Lock)	BD , פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי	302995
15μ 96 לוחות שחורים היטב (צלחת #1 להדמיה)	In Vitro Scientific, סאניווייל, קליפורניה	P96-1-N
16% פרפורמאלדהיד	מדע מיקרוסקופ אלקטרונים, האטפילד, פנסילבניה	15710
בקבוק מטופל תרבית רקמה 75 ס"מ רבוע	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	430641
אגר (אבקה)	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	A1296
בייבי ארנב משלים	Cedarlane Labs , ברלינגטון, קרוליינה הצפונית	CL3441
תמצית שמרי Bacto	BD, ספארקס, MD	288620
עירוי לב מוח BBL (BHI)	BD, ספארקס, MD	211059
צלחות אגר דם (TSA עם דם כבשים)	Remel, Lenexa, KS	₪11198
מגרד תאים	זארשטדט, ניוטון, קרוליינה הצפונית	83.183
קוסטאר 96 צלחות תרבית תאים (צלחות #2 ו -3 לדילול)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	3596
כיסוי זכוכית	מדע מיקרוסקופ אלקטרונים, האטפילד, פנסילבניה	72200-10
מרק תזונתי Difco	BD, ספארקס, MD	234000
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), גלוקוז גבוה	Gibco, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	11965-092	מכיל 4500 מ"ג/ליטר גלוקוז, 4 mM L-גלוטמין, פנול אדום
מערכת EVOS FL Auto Cell Imaging System (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
סרום בקר עוברי	Hyclone, GE Healthcare מדעי החיים, דרום לוגן, יוטה	SH30071.03	לא גמא מוקרן, לא חום מנוטרל
פלואורסצאין איזותיוציאנט	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	F143
HCS מסכת תא כתום כתם תא	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	H32713
המוציטומטר (נויבאואר משופר)	Hausser Scientific, הורשאם, פנסילווניה	3900
פתרון דיו הודו	BD, ספארקס, MD	261194
L- גלוטמין (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם מסצ'וסטס	25030081	תוסף בינוני עם תוספת של 2mM L-גלוטמין
Nikon Eclipse TE2000-U (מיקרוסקופ מורכב הפוך)	Nikon Instruments, מלוויל, ניו יורק	TE2000
PBS ללא סידן או מגנזיום	לונזה, ווקרסוויל, מרילנד	17-516F
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, פי 100	Hyclone, GE Healthcare מדעי החיים, דרום לוגן, יוטה	SV30010
צלחות פטרי (100 x 15 מ"מ)	פלקון, קורנינג, דורהם, קרוליינה הצפונית	351029	לצלחות אגר
קו תאי מקרופאג RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, מנסאס, וירג'יניה	ATCC TIB-71
שקופיות	VWR, Radnor, PA	16004-422
סודיום ביקרבונט	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	S5761
טריפאן בלו תמיסה (0.4%)	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	T8154
Zeiss 700 מיקרוסקופ סריקת לייזר (מיקרוסקופ קונפוקלי)	Carl Zeiss Microimaging , ת'ורנווד, ניו יורק	4.109E+15