בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

תקציר

מקור: Chua, J., et al. Opsono-Adherence Assay להערכת נוגדנים פונקציונליים בפיתוח חיסונים נגד Bacillus anthracis ופתוגנים עטופים אחרים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים בדיקת היצמדות אופסונו-לבחינת האינטראקציה בין חיידקים שעברו אופסונציה לבין תאי מערכת החיסון. חיידקים המסומנים בפלואורסצנטית, מטופלים בסרום בדיקה המכיל נוגדנים נגד קפסולות, מודגרים עם מקרופאגים. לאחר צביעת המקרופאגים בפלואורסצנטיות, החיידקים המחוברים על פני המקרופאגים נצפים תחת מיקרוסקופ לצורך הדמיה.

פרוטוקול

1. תרבית חיידקים ותכשירים

הערה: זן החיידקים המשמש בפרוטוקול זה הוא זן אלים עטוף, B. anthracis Ames. כל המניפולציות עם מין זה דורשות בטיחות ביולוגית מתאימה וסיווג ביטחוני ויש לבצע אותן בארון בטיחות ביולוגי Class II או Class III הממוקם במעבדה BSL-3. בצע את נהלי ההפעלה המוסדיים לעבודה BSL-3 ולשימוש בציוד מגן אישי בעת טיפול בחיידקים.

1. הכינו ציר עירוי לב למוח (BHI) על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ב-1 ליטר מים וכריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות. אחסנו את המרק בטמפרטורת הסביבה.
2. מכינים תמיסת ביקרבונט נתרן 8% במים ומעקרים באמצעות מזרק מסנן 0.20 מיקרומטר. יש לאחסן את התמיסה בטמפ....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר (25 מ"מ, תאית מתחדשת)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	431222
מזרק 10 מ"ל (קצה Luer-Lock)	BD , פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי	302995
15μ 96 לוחות שחורים היטב (צלחת #1 להדמיה)	In Vitro Scientific, סאניווייל, קליפורניה	P96-1-N
16% פרפורמאלדהיד	מדע מיקרוסקופ אלקטרונים, האטפילד, פנסילבניה	15710
בקבוק מטופל תרבית רקמה 75 ס"מ רבוע	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	430641
אגר (אבקה)	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	A1296
בייבי ארנב משלים	Cedarlane Labs , ברלינגטון, קרוליינה הצפונית	CL3441
תמצית שמרי Bacto	BD, ספארקס, MD	288620
עירוי לב מוח BBL (BHI)	BD, ספארקס, MD	211059
צלחות אגר דם (TSA עם דם כבשים)	Remel, Lenexa, KS	₪11198
מגרד תאים	זארשטדט, ניוטון, קרוליינה הצפונית	83.183
קוסטאר 96 צלחות תרבית תאים (צלחות #2 ו -3 לדילול)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	3596
כיסוי זכוכית	מדע מיקרוסקופ אלקטרונים, האטפילד, פנסילבניה	72200-10
מרק תזונתי Difco	BD, ספארקס, MD	234000
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), גלוקוז גבוה	Gibco, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	11965-092	מכיל 4500 מ"ג/ליטר גלוקוז, 4 mM L-גלוטמין, פנול אדום
מערכת EVOS FL Auto Cell Imaging System (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
סרום בקר עוברי	Hyclone, GE Healthcare מדעי החיים, דרום לוגן, יוטה	SH30071.03	לא גמא מוקרן, לא חום מנוטרל
פלואורסצאין איזותיוציאנט	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	F143
HCS מסכת תא כתום כתם תא	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם, מסצ'וסטס	H32713
המוציטומטר (נויבאואר משופר)	Hausser Scientific, הורשאם, פנסילווניה	3900
פתרון דיו הודו	BD, ספארקס, MD	261194
L- גלוטמין (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, וולת'הם מסצ'וסטס	25030081	תוסף בינוני עם תוספת של 2mM L-גלוטמין
Nikon Eclipse TE2000-U (מיקרוסקופ מורכב הפוך)	Nikon Instruments, מלוויל, ניו יורק	TE2000
PBS ללא סידן או מגנזיום	לונזה, ווקרסוויל, מרילנד	17-516F
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, פי 100	Hyclone, GE Healthcare מדעי החיים, דרום לוגן, יוטה	SV30010
צלחות פטרי (100 x 15 מ"מ)	פלקון, קורנינג, דורהם, קרוליינה הצפונית	351029	לצלחות אגר
קו תאי מקרופאג RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, מנסאס, וירג'יניה	ATCC TIB-71
שקופיות	VWR, Radnor, PA	16004-422
סודיום ביקרבונט	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	S5761
טריפאן בלו תמיסה (0.4%)	Sigma-Aldrich , סנט לואיס, מיזורי	T8154
Zeiss 700 מיקרוסקופ סריקת לייזר (מיקרוסקופ קונפוקלי)	Carl Zeiss Microimaging , ת'ורנווד, ניו יורק	4.109E+15

כתום