הערכה של הפעלה מבוקרת של תאי T עם פפטיד MHC הניתן להפעלה

תקציר

מקור: Sanchez, E., et al. בקרה מרחבית וזמנית של הפעלת תאי T באמצעות אגוניסט פוטואקטיבטיבי. J. Vis. Exp. (134), (2018)

סרטון וידאו זה מדגים שיטה לפירוק קומפלקס היסטותאימות פפטיד מז'ור הניתן להפעלה באמצעות קרינת UV. תהליך הדעיכה חושף את רצף הפפטידים, ומאפשר הפעלה מדויקת של תאי T.

פרוטוקול

1. הכנת משטחי זכוכית מגרים

1. ציפוי זכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים היטב בפולי-L-ליזין (Bio-PLL) מדולל בקנ"מ 1:500 במים מזוקקים ונטולי יונים. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
2. יש לשטוף עם H₂O.
3. יבש במשך שעתיים ב- RT.
4. חסום משטחים מצופים Bio-PLL עם חיץ חוסם (מלח חוצץ HEPES [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], עם 2% BSA) למשך 30 דקות ב- RT.
   1. להמיס 5 מ"ג של פולי-L-ליזין הידרוברומיד ב 1 מ"ל של 10 mM NaPO4, pH 8.5.
   2. הוסף 125 μmol (0.55 מ"ג) של NHS-biotin (ממלאי של 100 מ"ג / מ"ל ב- DMSO) ובדוק את ה- pH של התגובה. אם ה- pH נמוך מ- 8.5, הוסף 2 μL של 4 N NaOH כדי להעלות אותו בין pH 8.5 ל- 9.5.
   3. מערבולת במשך 30 דקות.
   4. להרוות את התגובה עם 50 μL של 100 mM גליצין מומס ב 20 mM Tris pH 8.0.
   5. מסתובבים במלוא העוצמה במשך 10 דקות ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש.
      הערה: איכות Bio-PLL מושווית בדרך כלל לתכשירים קודמים על ידי ציפוי דילול סדרתי כפול של החומר על צלחת ELISA של 96 בארות וכימות תכולת הביוטין לאחר הדגירה עם סטרפטווידין מצומד לפוספטאז אלקליין.
5. הסר את מאגר החסימה. אין לאפשר לבארות להתייבש. הוסף סטרפטאבידין (100 מיקרוגרם/מ"ל במאגר חוסם). לדגור במשך 1 שעה ב 4 ° C.
6. יש לשטוף ב-HBS. למלא ולהפוך בארות תא להחליק 4 - 5 פעמים, הסרת HBS מן הבארות. אין לאפשר לבארות להתייבש.
7. הוסף את ליגנדות pMHC ביוטינילציה ומולקולות היצמדות לפני השטח.
   הערה: MCC ו-OVA ניתנים לפוטו-כלוב על-ידי הוספת קבוצות הגנה מבוססות אורתו-ניטרובנזיל (למשל, ניטרופנילאתיל (NPE) או ניטרובלטרילוקסיקרבוניל (NVOC)) לקבוצת האמינו ε של ליזין מפתח (K12 ב-MCC, K7 ב-OVA). ניתן להשיג MCC ו- OVA בכלוב צילום מספקים מסחריים. לאחר הרכבה מחדש בחיץ מימי, הם מקופלים מחדש לביטוי חיידקי I-E^k ו- H2-K^b באמצעות גישות מבוססות.
8. אימות של פפטיד MCC או OVA הניתן להפעלה
   1. יש לנטרל פפטידים המוגנים באמצעות NVOC על ידי הקרנת UV באמצעות מנורת UV ידנית (ראה טבלת חומרים) למשך 20 דקות ב-RT.
   2. פולס 1.0 x 10⁵ APCs עם 1 מיקרומטר של פפטיד לא מגרה (בקרה שלילית, למשל Hb), פפטיד photoactivatable לא מוקרן, פפטיד photoactivatable מוקרן ופפטיד אגוניסט (בקרה חיובית, למשל, MCC) במשך 1 שעה עד לילה ב 37 ° C.
   3. כדי לעורר תאי T המבטאים את 5C. C7/2B4/ו- TCR, השתמש בתאי CH12 או CH27 B. כדי לעורר תאי OT1 T, השתמש בתאי תימומה RMA-s או EL4.
   4. מערבבים את הנגמ"שים הפועמים עם מספר שווה של תאי T בלוחות תחתונים עגולים של 96 בארות בנפח סופי של 200 μL. דוגרים ב-37°C למשך 12-24 שעות.
   5. לשחזר את supernatants מכל באר ולנתח IL-2 על ידי ELISA עם streptavidin-horseradish peroxidase colorimetric detection.
      הערה: מומלץ מאוד לאשר את מצב הכלוב של כל הפפטידים על ידי ספקטרומטריית מסות בתרסיס חשמלי לפני קיפול מחדש למתחמי MHC.
9. בצע קיפול וטיהור של MHC כדי למזער את החשיפה לאור. לדוגמה, לעטוף תגובות קיפול ברדיד אלומיניום ולבצע כרומטוגרפיה סינון ג'ל עם מנורת UV כבוי.
   הערה: נמצא כי MCC- I-E^k ו- OVA- H2-K^b הניתנים להפעלה פוטואקטיבית גורמים להפעלת תאי T שאינם תלויים ב- UV בצפיפות גבוהה, אולי עקב כלוב פונקציונלי לא שלם. לפיכך, ה-pMHC הניתן להפעלה מדולל לעודף של פי 10-30 של pMHC לא מגרה (למשל I-E^k המכיל את פפטיד ההמוגלובין (Hb)) במהלך שלב האימוביליזציה. זה משפר את יחס האות לרעש של ניסוי ההדמיה הבא.
10. כדי לבצע פוטואקטיביזציה של תאי T מסוג CD4⁺, השתמשו ביחד בתערובת של Hb-I-Ek ביוטינילציה (3 מיקרוגרם/מ"ל), MCC-I-E^k הניתן להפעלה פוטו-אטינילית (0.1 מיקרוגרם/מ"ל), ונוגדן ביוטינילציה כנגד סוג I MHC H2-K^k (0.5 מיקרוגרם/מ"ל). הנוגדן נגד^{H2-K k} מעודד 5C. תאי C7/2B4/AND T, המבטאים H2-K^k, מתפשטים על משטח הזכוכית מבלי לעבור הפעלה.
11. עבור תאי CD8⁺ T, השתמש בתערובת של H2-Db ביוטינילציה הנושאת את הפפטיד KAVYDFATL (1 מיקרוגרם / מ"ל), OVA-H2-Kb פוטואקטיבטיבי ביוטינילציה (0.1 מיקרוגרם / מ"ל), ואת התחום החוץ תאי של מולקולת ההדבקה ICAM-1 (2 מיקרוגרם / מ"ל המיוצר על ידי תרבית תאי חרקים). ICAM-1 מעודד יצירת מגע קרוב על ידי הפעלת האינטגרין LFA1 על פני תא T.
12. יש למרוח את כל תערובות החלבונים במאגר חוסם, ולאחר מכן לדגור במשך שעה אחת ב-RT או לפחות שעתיים ב-4°C.
    הערה: הצפיפות המולקולרית על משטחים מסוג זה היא ~8000 למיקרומטר רבוע נקבעה בעבר. בהתחשב בכך ש-pMHC הניתן להפעלה מייצג ~1/30 מהחלבון הביוטינילציה על פני השטח, צפיפותו תהיה ~267 מולקולות למיקרומ"ר, לפני הירידה.
13. יש לשטוף כמו בשלב 1.6 ולהשאיר ב-HBS עד שהוא מוכן לשימוש.
14. הוסף 200,000 תאי CD4⁺ או CD8⁺ T המבטאים את ה- TCR המתאים לכל באר ואפשר לתאים להיצמד ב- 37 ° C למשך 15 דקות. ברגע שהתאים התחברו והתפשטו על פני השטח, הם מוכנים לפוטואקטיבציה והדמיה.
    הערה: התמרה רטרו-ויראלית של תאי T משפיעים עם בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות מתוארת בפירוט במקום אחר. איתות סידן יכול להיחקר גם באמצעות תאי T לא מותמרים עמוסים בצבע הרגיש לסידן Fluo-46. הצבע היחסי Fura-2 אינו מומלץ מכיוון שהוא דורש עירור בתחום UV, אשר גם גורם לירידה של pMHC הניתן להפעלה.

2. רכישת תמונות

1. השתמש במיקרוסקופ TIRF הפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית 150X תואמת UV לרכישת תמונה. הקרנת UV באזורים המוגדרים על-ידי המשתמש באמצעות מערכת דיאפרגמה דיגיטלית המחוברת למנורת כספית של 100 ואט (HBO). כוונו את אור ה-UV מנורה זו אל הדגימה באמצעות מראה באורך 400 ננומטר.
2. השתמש בתוכנה לניתוח תמונה עבור פוטואקטיבציה מקומית ורכישה בהילוך מהיר. ברוב הניסויים, עקוב אחר גשושיות הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה. אור הלייזר מופנה אל הדגימה באמצעות מראה דיכרואית בעלת פס כפול המשדרת גם בתחום ה-UV (כדי לאפשר דעיכה). אנא עיינו בטבלת החומרים ובאיור 1 למידע נוסף על תצורת המיקרוסקופ.
3. לאחר הרכבת שקופית התא המכילה את תאי T, התאם את ההגדרות לקבלת תאורת TIRF או אפיפלואורסצנציה, לפי הצורך. במצב חי, בחר שדה של תאים המבטאים את הבדיקה הפלואורסצנטית המעניינת. קבע אזורים בקנה מידה מיקרוני עבור פוטואקטיבציה מתחת לתאים בודדים באמצעות בקרת תוכנה.
4. התחל רכישה בהילוך מהיר. בדרך כלל, 80 נקודות זמן נרכשות, עם מרווח של 5 שניות בין כל נקודת זמן. זה משאיר די והותר זמן לחשיפות רציפות של 488 ננומטר ו-563 ננומטר, במקרה של ניסויי צבע כפולים.
5. לאחר 10 נקודות זמן, הפעל את האזורים שנבחרו על ידי פתיחת תריס הסרעפת הדיגיטלי למשך 1 - 1.5 שניות.
6. לאחר השלמת קיטועי הזמן, בחר שדה תאים חדש וחזור על התהליך.

תוצאות

איור 1: תצורת מיקרוסקופ עבור פוטואקטיבציה והדמיית TIRF.

488 ננומטר ולייזרים 561 ננומטר משמשים להדמיית TIRF ואפיפלואורסנציה של בדיקות ירוקות ואדומות, בהתאמה. אור UV לצורך פוטואקטיבציה נלקח מנורת כספית (כספית) המחוברת למערכת דיאפרגמה דיגיטלית המסוגלת להאיר אזורים קטנים המוגדרים על-ידי המשתמש. אור מהמנורה/דיאפרגמת Hg מוחזר על הדגימה על ידי מראה בעלת מעבר ארוך הממוקמת מתחת למר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	תרמופישר סיינטיפיק	155361
פולי-ל-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P2636	יהיה צורך לייצר פולי-L-ליזין Biotinylated
EZ-Link NHS-ביוטין	תרמופישר סיינטיפיק	20217	יהיה צורך לייצר פולי-L-ליזין Biotinylated
סטרפטאבידין	תרמופישר סיינטיפיק	434301
BirA-500: ערכת תגובה סטנדרטית של BirA ביוטין-חלבון ליגאז	אווידיטי	BirA500	ישמש לביוטינילט חלבונים
ביוטיניל Hb I-EK			לקיפול חלבונים, ראו הערה 6. לביוטינילציה יש להשתמש בערכת BirA
NPE-MCC I-EK ביוטינילציה	אנאספקט		ניתן לרכוש NPE-MCC (HANERADLIAYL-K(NVOC)-QATKOH מותאם אישית מ- Anaspec
נוגדן αH2-Kk ביוטינילציה	BD Biosciences	553591
ביוטינילציה NPE-OVA H2-Kb	אנאספקט		מותאם אישית NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) ניתן לרכוש מ Anaspec
KAVY H2-DB ביוטינילציה	אנאספקט		חלבון מסונתז מותאם אישית (KAVYDFATL) ניתן לרכוש מ Anaspec
ICAM1 ביוטינילציה			לקיפול חלבונים, ראו התייחסות בפרוטוקול. לביוטינילציה יש להשתמש בערכת BirA
מנורת UV ידנית	UVP	UVGL-25	המנורה מוחזקת < 1 ס"מ מהדגימה. 30 שניות של אור 365 מספיקות להפחתה ניתנת לזיהוי, 20 דקות לדקיטינג כמותי.
אולימפוס IX-81 OMAC מערכת TIRF.	אולימפוס		מידע נוסף על מערכת ההדמיה ניתן למצוא באיור 6
דיאפרגמה דיגיטלית פסיפס	אנדור
תוכנת מצגת	חידושים בתחום ההדמיה החכמה