$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת תאי T אנושיים CD4+ Th1 Effector/Memory
- החל חוסם עורקים על זרועו של התורם, לנגב את הווריד עם אלכוהול, ולהכניס מחט. לאט לשאוב 15 מ"ל של דם לתוך vacutainer באמצעות EDTA כמו נוגד קרישה. כאשר הדם נשאב, להתיר את חוסם העורקים לפני הסרת המחט. מיד להחיל לחץ על הפצע עם גזה סטרילית כאשר המחט מוסרת.
- מעבירים דם לצינור של 50 מ"ל. מוסיפים RPMI-1640 ב-RT בדילול 1:1 (נפח סופי 30 מ"ל). שכבו בזהירות את הדם המדולל על שתי צינוריות 50 מ"ל המכילות 15 מ"ל של מדיום בידוד לימפוציטים מסונן מראש כגון Ficoll-Paque at RT.
- צנטריפוגה את השיפוע ב-RT למשך 30 דקות במהירות של 1,200 x גרם ברוטור דלי מתנדנד. בזמן הצנטריפוגה להכין תא T בינוני (500 מ"ל של RPMI-1640, 50 מ"ל FCS, 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין).
- עם הוצאת צינור 50 מ"ל מהצנטריפוגה, שימו לב לארבע שכבות: גלולה של תאי דם אדומים בתחתית, הפאק, שכבת תאים המכילה תאי דם לבנים (כולל לימפוציטים) והפלזמה. בזהירות להסיר את שכבת תאי הדם הלבנים עם פיפטה פסטר ולהעביר אותו 50 מ"ל צינור פלקון.
- שטפו את שכבת תאי הדם הלבנים על ידי הוספת RT RPMI-1460 (עד 20 מ"ל) וצנטריפוגה ב-RT למשך 5 דקות ב-1,200 x גרם. השהו מחדש את תאי הדם הלבנים ב-1 מ"ל של תווך תאי T. הוסף 5 μl של תרחיף התא 1 מ"ל ל 250 μl T תא בינוני בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל וערבב בעדינות למעלה ולמטה על ידי פיפטה.
- הוסף 25 μl תרחיף תאים מדולל ל 25 μl 0.4% Trypan כחול. הוסף 10 μl של תערובת לכל צד של hemocytometer סטנדרטי.
- הניחו את ההמוציטומטר על מיקרוסקופ אור בעוצמה נמוכה. באמצעות מטרה של פי 10 לספור את מספר התאים החיים אשר לא כללו את הצבע הכחול טריפאן נמצאים בריבוע האמצעי של שני הצדדים של המוציטומטר.
- כדי לחשב את ריכוז התא, הכפל את הממוצע של 2 הריבועים ב- 100 (גורם דילול) ולאחר מכן הכפל ב- 104 כדי לתת את מספר התאים / מ"ל.
- התאם את הריכוז הסופי ל- 0.5 x 106 תאים/מ"ל בתווך תאי T. הוסף ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של סופר-אנטיגנים חיידקיים staphylococcal enterotoxin B (SEB) ורעלן תסמונת הלם רעיל 1 (TSST) לתאים. תרבית במשך 72 שעות (37 ° C ו 5% CO2) כדי להרחיב את אוכלוסיית תאי CD4+ T.
- תאי T גלולתיים (1,200 x גרם, 5 דקות) והשעיה מחדש ב 0.5 x 106 תאים / מ"ל בתווך תא T עם תוספת של IL-15 אנושי (20 ng / ml). מעבירים לימפוציטים לצלוחית T150. המשך להרחיב/לפצל תאים ב- MEDIUM-IL-15 מלא כל 24-48 שעות לפי הצורך (מבוסס על צבע חומרי הדפסה; כלומר, בכל פעם שהמדיה הופכת מוורוד לצהוב מעט) לאחר מכן. לשמור על אוכלוסיית הלימפוציטים המתקבלת עד 15 ימים.
הערה: על פי התכנון, פרוטוקול זה יפעיל וירחיב באופן ספציפי תת-קבוצה של תאי CD4+ T המגיבים ל-SEB ול-TSST ולאחר מכן יניע אותם לעבר אפקטור/פנוטיפ זיכרון דמוי Th1. תאי דם לבנים אחרים אינם מצליחים לשרוד ולגדול בתנאים אלה, כך שבשלב 1.10 התאים יהיו לפחות 95% תאי CD4+, CD45RO+ T, כפי שניתן להעריך בקלות על ידי ציטומטריית זרימה. אם תרצה, ניתן להשיג טיהור נוסף בקלות באמצעות ערכות בחירה חיובית או שלילית המבוססות על נוגדנים/חרוזים מגנטיים.
2. התחלת תרבית תאי אנדותל ראשונית אנושית
- מצפים בקבוק T25 בפיברונקטין (FN) 20 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS בתנאים סטריליים. השאירו ב-RT למשך 30-60 דקות. הסר FN והוסף 5 מ"ל מדיום מלא (מדיום בסיסי אנדותל (EBM-2) בינוני בתוספת מדיום צמיחה אנדותל (EGM-2) singlequots). טרום דגירה באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
- הפשירו בקבוקון של תאי אנדותל אנושיים קפואים או תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים (HLMVECs או HDMVECs) באמבט מים של 37°C עם תסיסה עדינה מדי פעם למשך ~2-3 דקות. העבירו מיד תאים לבקבוק T25 המכיל מדיה מחוממת מראש. מערבלים בעדינות ומניחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- שנה את המדיה לאחר ~ 4-6 שעות. המשך להחליף מדיה בערך כל 48 שעות (או כאשר המדיה הופכת מעט צהובה) עד שהלוח מגיע ~ 90-95% מפגש.
3. פיצול כללי והרחבה של תאי אנדותל
- לגדל תאים למפגש ~ 90-95. פעולה זו עשויה להימשך 2-5 ימים. לפיצול, הסר את המדיה ושטוף עם PBS. הסר PBS והחלף בנפח מינימלי של טריפסין טרי 1x טרי (0.5 מ"ל עבור T25 או 1.5 מ"ל עבור T75). מערבלים בעדינות כדי לכסות את כל המשטחים בטריפסין. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך ~5 דקות. עקוב אחר ניתוק התאים מהצלחת באמצעות מיקרוסקופ אור בעוצמה נמוכה.
- כאשר רוב התאים נראים מעוגלים או מנותקים, יש להוסיף 5 נפחים (כלומר, בהשוואה לנפח הטריפסין שנוסף) של מדיום EGM-2 מלא שחומם מראש ופיפטה עדינה על פני השטח של הבקבוק כדי לנתק את כל התאים.
- ספירת תאי אנדותל עם המוציטומטר כמתואר בסעיפים 1.6-1.7. משחררים את התאים בצנטריפוגה (5 דקות, 1,200 x גרם). הסר את supernatant. כוונן את הריכוז ל-0.5 מיליון תאים למ"ל על-ידי תוספת של מדיית EGM-2 MV מלאה שחוממה מראש.
- העבר aliquots של תאים לכלים או צלוחיות מצופים FN המתאימים לתחזוקה. מערבלים בעדינות ומניחים באינקובטור. החליפו את המדיה תוך 6-12 שעות מציפוי. יש להחליף מדיה בערך כל 48 שעות לאחר מכן.
4. טרנספקציה של תאי אנדותל
הערה: תאי אנדותל ראשוניים עמידים בפני טרנספקציה בשיטות הכימיות והאלקטרופורציה הנפוצות ביותר. השיטה מבוססת הטרנספקציה הגרעינית המתוארת להלן מאפשרת יעילות טרנספקציה גבוהה יחסית (~50-70%). שיטה חלופית יעילה היא שימוש בזיהום על ידי וקטורים נגיפיים מתאימים (ראה הערות בטבלת חומרים).
- הכינו צלוחיות T25 או T75 (לפי הצורך) של HLMVECs או HDMVECs לצפיפות סופית של 90-95% מפגש. ציפוי עם פיברונקטין (FN) 20ug/ml ב- PBS בתנאים סטריליים או לוחות תרבית במיקרוסקופ כגון לוחות Delta-T (לשלב 5) או כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 מ"מ המונחים בתוך באר של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות (לשלב 6) עם כמתואר לעיל (2.1).
- יש להוסיף 1 מ"ל של מצע תרבית EGM-2 שלם לצלחות תרבית במיקרוסקופ או 0.5 מ"ל לכל 24 בארות ולאזן את הצלחות באינקובטור לח של 37°C/5% CO2.
- קצור וספור תאי אנדותל כמו בשלבים 3.1-3.3. צנטריפוגה את נפח התאים הנדרש (0.5 מיליון תאים לדגימה) ב 1,200 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשעות מחדש את גלולת התא בזהירות בתמיסת טרנספקציה גרעינית RT 100 μl לכל דגימה.
- שלב 100 μl של תרחיף תאים עם 1-5 מיקרוגרם DNA. העברת תרחיף תא/DNA לקובט מאושר; הדגימה חייבת לכסות את תחתית הקובטה ללא בועות אוויר.
הערה: מבנים המכוונים YFP או DsRed לקרום התא (דרך N-terminal 20 חומצות אמינו של נוירומודולין המכיל אות עבור palmitoylation לאחר תרגום) שימשו לבד (קרום-YFP לבד או קרום-DsRed בלבד) או co-transfected עם סמן נפח ציטופלזמי (למשל, קרום-YFP ו- DsRed מסיס). ניתן להשתמש בתמורות רבות של סמני חלבון פלואורסצנטיים.
- סגור את הקובטה עם הכובע. הכנס את הקובטה עם תרחיף תא/DNA למחזיק הקובט של האלקטרופורטור והפעל תוכנית אלקטרופורציה S-005. הוציאו את הקובט מהמחזיק לאחר סיום התוכנית.
- הוסף ~ 500 μl של מדיית התרבית המאוזנת מראש לקובט והסר בעדינות את תרחיף התא מהקובטה באמצעות פיפטות העברת הפלסטיק המסופקות בערכת הטרנספקציה הגרעינית.
- בניסויים באמצעות תרבית מיקרוסקופ, לוחות מפרידים את תרחיף התא מתגובה אחת באופן שווה בין שתי צלחות המכילות מדיה מחוממת מראש (שלבים 4.2-4.3). עבור ניסויים באמצעות 24 בארות/צלחות, יש לחלק תגובה אחת שווה בשווה בין 3 בארות.
- לדגור על התאים באינקובטור לח של 37°C/5% CO2 ולהחליף מדיה 4-6 שעות, ושוב ב-12-16 שעות לאחר הטרנספקציה.
5. דימות וניתוח תאים חיים
- הכנת אנדותל
- יום 0: העברה משותפת של HLMVECs ראשוניים עם ממברנה-YFP ו-DsRed מסיס באמצעות טכנולוגיית נוקלאופקציה כמתואר בשלב 4 ולוחית על לוחות תרבית הדמיה של תאים חיים.
- יום 1: יש להחליף את המדיום בתווך טרי המכיל IFN-γ (100 נ"ג/מ"ל) כדי לגרום לביטוי MHC-II. ביום השני. לעורר תאים נגועים על ידי תוספת של 20 ng/ml TNF-α למדיה הקיימת.
- ביום השלישי, יש לדגור על האנדותל עם 1 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מהסופר-אנטיגנים החיידקיים סטפילוקוקל אנטרוטוקסין B (SEB) ורעלן תסמונת ההלם הרעיל 1 (TSST) בטמפרטורה של 37°C למשך 30-60 דקות מיד לפני הניסויים. השמט שלב זה עבור תנאי בקרה '-Ag'.
- הכנת לימפוציטים
- במקביל לשלב 5.1.3, הכינו את Buffer A (HBSS נטול אדום פנול) בתוספת אלבומין בסרום אנושי של 20 mM, pH 7.4 ו-0.5% v/v בסרום אנושי שחומם מראש ל-37°C. קח מדגם של לימפוציטים בתרבית ולקבוע את הצפיפות על ידי ספירה עם hemocytometer (שלב 1.12-1.17).
- צנטריפוגה 2 מיליון תאים לדגימה ב 1,200 x גרם במשך 5 דקות ב RT בצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לשאוף מדיה ולהשהות בעדינות את גלולת התא ב-2 מ"ל של חיץ A כך שלא יישארו אשכולות תאים.
- הסר aliquot טרי של צבע סידן Fura-2 והשהה מחדש ב- DMSO כדי ליצור ריכוז מלאי של 1 mM.
- הוסף 2 μl של תמיסת מלאי Fura-2 לתרחיף תאי T (ריכוז סופי של 2 μM), סגור את הצינור וערבב מיד על ידי היפוך הצינור כדי להבטיח פיזור אחיד של הצבע. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה כמו בשלב 5.2.2. לשאוף Buffer-A ובעדינות אך ביסודיות להשהות לימפוציטים ב 20-40 μl של Buffer-A טרי.
- הגדרה ורכישה של הדמיית תאים חיים
הערה: ניתן להשתמש במגוון רחב של מערכות להדמיית פלואורסצנטיות של תאים חיים במיקרוסקופ אור זקוף והפוך. הדרישות הבסיסיות כוללות מקור אור פלואורסצנטי ומסננים, מצלמת CCD, מיתוג מסנן ממונע ותריסים, במה מחוממת (או תא מחומם הניתן להרכבה במיקרוסקופ) ותוכנה לרכישת תמונה אוטומטית. עבור פרוטוקול זה נדרשות עדשות טבילה בשמן עם מפתח צמצם מספרי גבוה והגדלה גבוהה (כלומר, 40X, 63X) כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית הדרושה. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בבחירת המקור הפלואורסצנטי המתאים והעדשות להדמיית סידן מבוססת Fura-2 מכיוון שלא כולן תואמות את אורכי גל העירור הנדרשים של 340/380 ננומטר. ניתן להשתמש בגישה חלופית (התואמת לערכות סטנדרטיות של מסננים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים) עם צבעים שאינם יחסיים רגישים לסידן (למשל, Fluo-4, Rhod-3), אם כי אלה אינם יכולים לכמת במדויק את שטף הסידן ומספקים רק קריאה יחסית/כמותית.
- הפעל את מערכת המיקרוסקופ (מחשב לפעולה, מיקרוסקופ, מצלמת CCD, גלגל מסנן ומנורת קסנון).
- פתח את התוכנה המיועדת.
- הגדר מיקרוסקופ/תוכנה להדמיה אוטומטית רב-ערוצית בהילוך זמן. כלול רכישה רציפה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), פלואורסצנטיות ירוקה סטנדרטית, פלואורסצנטיות אדומה סטנדרטית ותמונות Fura-2 סטנדרטיות של עירור 340 ו- 380 ננומטר. הגדר את מרווח הזמן לרכישה למשך 10-30 שניות ומשך כולל של ~ 20-60 דקות.
- קבעו זמני חשיפה להדמיית Fura-2.
- מוסיפים שמן אובייקטיבי טרי ומרכיבים צלחת מיקרוסקופ המכילה רק 0.5 מ"ל של Buffer-A על מתאם שלב החימום ומיד מפעילים לאיזון ל 37 ° C (ייקח ~ 2-3 דקות).
- הוסף לימפוציטים טעונים Fura2 במנוחה לתא צלחת המיקרוסקופ המותקן באמצעות פיפטה של 20 μl.
- הפעל הדמיית שדה בהיר. בחרו בנתיב האור לעיניות. השתמש בידית המיקוד הגסה כדי להביא את המטרה במגע עם החלק התחתון של צלחת המיקרוסקופ. השתמשו בעינית ובידית המיקוד העדינה כדי להתמקד בתאי T הממוקמים בתחתית המנה.
- השתמש בפקדי שלב x-y כדי לבחור שדה המכיל לפחות 10 תאים. הימנע משדות צפופים מדי וגושי תאים מכיוון שאלה ייצרו תוצרי הדמיה.
- מעבר משדה בהיר למקור אור פלואורסצנטי. עבור מהדמיית עינית למצלמת CCD. הגדר פרמטרים של רכישה (לדוגמה, זמן חשיפה, רווח גלאי ובינינג). באמצעות התוכנה רוכשים תמונות מנוחה של Fura2-340 ו-Fura2-380 (החל מזמן חשיפה זהה לכל אחת מהן, בדרך כלל בטווח של ~200-1,000 מילישניות).
- השתמש בשיטות המתוארות בשלב 5.4.1 כדי לחשב את Fura2-340/Fura2-380 עבור כל לימפוציטים. בצע חזרות חוזרות ונשנות של התאמת זמני החשיפה של Fura2-340 ו- Fura2-380, רכישת תמונות וחישוב היחסים עד שהערכים הממוצעים קרובים ל- 1.
- הגדר זמני חשיפה עבור mem-YFP ו- DsRed.
- החלף את צלחת המיקרוסקופ המשמשת בשלב 5.3.3.1 בצלחת מיקרוסקופ המכילה HLMVECs או HDMVECs נגועים, מופעלים ומטופלים ב- SAg (או לא מטופלים; בקרה) HLMVECs או HDMVECs מאינקובטור תרביות התאים (שלבים 4.5.1). השתמש פיפטה העברה חד פעמית כדי להסיר במהירות מדיה, לשטוף פעם אחת את תוספת של ~ 1 מ"ל של Buffer-A שחומם מראש. לשאוף ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של Buffer-A.
- זהה שדות שבהם נמצאים תאי אנדותל חיוביים פלואורסצנטיים בהירים ונראים בריאים עם צמתים בין-תאיים בנויים היטב.
- התאם פרמטרים של רכישה (לדוגמה, זמן חשיפה, רווח גלאי ובינינג) עבור mem-YFP ו- DsRed. ודא שעוצמת האות הפלואורסצנטית הממוצעת בכל ערוץ נופלת בין 25% ל -75% מהטווח הדינמי של הגלאי.
- לערוך ניסויי הדמיה של תאים חיים.
- השתמש בתוכנה אוטומטית כדי להתחיל ברכישת תמונות וללכוד מספר מרווחי זמן של תמונות כדי ליצור תוכנית בסיסית.
- במהלך הרכישה, יש למרוח ~5 μl של לימפוציטים מרוכזים טעונים Fura-2 (משלב 5.2) למרכז שדה הדמיה צלחת המיקרוסקופ על ידי החדרת קצה של פיפטה בנפח קטן (P-5 או P-20) לתוך המדיה הקרובה למרכז המטרה ופליטה איטית.
- כאשר לימפוציטים מתיישבים בשדה ההדמיה, בצע התאמות עדינות במיקוד כדי להבטיח שהממשק בין תאי T לאנדותל (סינפסות אימונולוגיות) נשמר במישור המוקד. עם יעדים של 40 ו- 63X, ~ 10-20 תאים לכל שדה הם אופטימליים. אם נצפים פחות תאים בשדה ההדמיה, חזור על שלב 5.3.4.2.
- לאחר השלמת מרווח התצפית הרצוי של הניסוי, יש להמשיך בהדמיה ומיד לבצע פיפטה יונומיצין ישירות לתוך צלחת המיקרוסקופ (בטכניקה כמו ב-5.3.4.2) לריכוז סופי של 2 מיקרומטר כדי לגרום לאות איתות מקסימלי של שטף סידן/פורה-2 (כלומר, אמצעי כיול, ראה ניתוח 5.4).