$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מודל עכבר מהונדס להתפתחות סרטן השד
- התבונן בעכברים ממודל הסרטן הרצוי לצמיחת הגידול המתאימה באמצעות מישוש או מדידת קליפר לפני שתמשיך.
הערה: כאן נעשה שימוש במודל מורין מהונדס של התפתחות סרטן השד (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). בעלי חיים אלה מפתחים באופן ספונטני קרצינומה פולשנית של השד בין 6 ל -12 שבועות בכל בלוטת חלב. בלוטות חלב תקינות שימשו כבקרות מהמלטות שליליות טרנסגניות, תואמות גיל.
2. הזרקה תוך ורידית של סוכני נוגדנים ספציפיים ולא ספציפיים
- טיהור נוגדנים נגד עכבר B7-H3 ואימונוגלובולין G (IgG) של ארנב על עמודת התפלה (לדוגמה, PD-10) כדי להסיר חומרים משמרים ומאגרי אחסון בהתאם להוראות היצרן.
הערה: נוגדנים מסוימים עשויים להזדקק לטיהור נוסף עם פרוטוקול מבוסס חרוזי אגרוז Protein-A.
- מינון Aliquot של 33 מיקרוגרם של כל נוגדן מצומד בצינורות מיקרוצנטריפוגות בודדות.
הערה: המינון של הסוכן המנוהל עשוי להשתנות בהתאם ליישום ותואם את המינונים שבהם נוגדנים מצומדים משמש באופן שגרתי. ריכוז תמיסות הנוגדנים נדרש אם הנפח הוא יותר מ -100 μL לבטיחות בעלי חיים.
- בנקודת הזמן הרצויה לפני איסוף הרקמות, כאן 96 שעות, מרדימים את החיה נושאת הגידול עם 2% איזופלורן הזורם בחמצן ב 2 ליטר / דקה, ומניחים על שלב מחומם 37 מעלות צלזיוס. בצע צביטת בוהן כדי לוודא שרמת ההרדמה הנכונה הושגה לפני ההליך.
- כדי להתכונן לחיסון ורידים זנב של פתרונות נוגדנים, לחטא את הזנב של החיה על ידי ניגוב אותו שלוש פעמים עם מגבון אלכוהול. מרחיבים את ורידי הזנב על ידי חימומם עם כרית חום למשך כ-30 שניות. הימנעו מחימום כל החיה. נגבו את הזנב פעם נוספת עם מגבון אלכוהול לאחר הסרת כרית החום.
- באמצעות צנתר ורידי זנב 27G, הכנס את מחט הפרפר לאחד משני ורידי הזנב הצדיים וקיבע בזהירות את הזנב עם המחט המוחדרת לשלב עם חתיכת סרט כירורגי.
הערה: זרימת דם גלויה חזרה לתוך הצנתר מצביעה על המיקום הנכון של המחט בתוך וריד הזנב.
- שטפו את הצנתר ב-25 מיקרוליטר של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן הזריקו את תמיסת הנוגדנים לתוך הצנתר באמצעות מזרקי אינסולין. לשטוף את הצנתר שוב עם 25 μL של PBS סטרילי.
- הסר את המחט מהזנב והפעל לחץ כדי לעצור כל דימום.
- יש להפסיק את ההרדמה ולהתבונן בבעל החיים עד שהוא ער לחלוטין לסימני מצוקה.
3. איסוף והכנה של רקמות גידול היעד
- בנקודת הזמן הרצויה, הרדימו באופן הומני את בעל החיים על פי הנוהל המוסדי המקובל, כאן, על ידי שאיפה הדרגתית של 100% CO2 ממיכל גז דחוס עם קצב זרימת תזוזה של התא של 10-30% נפח / min.
הערה: יישומים מסוימים של טכניקת IVIL דורשים המתת חסד על ידי זילוח לב עם PBS כדי להסיר נוגדנים במחזור חופשי.
- לאחר אישור המתת חסד הומנית באמצעות הפסקת תנועה נשימתית ולבבית, חוסר תגובה של צביטת בוהן והאפרה של ריריות, הבלו רקמות הגידול באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים כדלקמן:
- הנח את העכבר במצב שכיבה ותופס רק את שכבת העור החיצונית בין מערכת בלוטות החלב הקרובה ביותר לזנב (5) עם מלקחיים, בצע חתך קטן עם זוג מספריים כירורגיים.
- הכניסו את המספריים הסגורים לתוך החתך ופתחו לאט את הקצה כדי להפריד בזהירות את העור מקרום דופן הבטן שמתחתיו, תוך שמירה על שלמותו.
- בצע חתך אנכי במעלה הבטן, ממשיך להפריד את העור מן הממברנה הפנימית. בין בלוטות החלב 3 ו -4, לבצע חתך אופקי על פני הבטן כדי לאפשר נסיגה של העור הדמיה של בלוטות החלב.
הערה: גידולי חלב ובלוטות ממוקמים באופן שטחי מתחת לעור.
- תופסים כל גידול או בלוטה רגילה במלקחיים, חותכים בזהירות את העור המחובר באמצעות מספריים כירורגיים.
- הכניסו את הרקמות שנכרתו לתבניות בסיס חד פעמיות של רקמות, מסומנות מראש וממולאות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ומקפיאים את התבניות במהירות על ידי הנחתן על קרח יבש. על מנת לחקור משלוח מחוץ למטרה, הבלו רקמות או איברים אחרים בעלי עניין (למשל, הכבד או הריאות).
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, אחסן בלוקים קפואים של רקמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן להמשיך.
- באמצעות הקפאה, חתכו גושי רקמה קפואים בעובי 10 מיקרומטר והניחו מקטעים סמוכים על שקופיות זכוכית הדבקה מסומנות מראש.
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, אחסן שקופיות בטמפרטורה של -80°C עד למוכנות להמשך.
4. פרוטוקול צביעת Ex vivo
הערה: לצורך השוואה כמותית בין תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כל השקופיות מוכתמות בו זמנית באותם פתרונות מוכנים.
- שטפו שקופיות רקמות קפואות עם PBS בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להסיר OCT.
- תיחום חלקי רקמות בעט מחסום הידרופובי כדי להפחית את נפח התמיסות הדרושות במהלך צביעה.
הערה: היזהר לא לאפשר לעט לדרוס את דגימות הרקמה מכיוון שהוא עלול להסיר את הרקמה מהמגלשה או למנוע כתמים נאותים על חלק הרקמה הפגוע. אין לאפשר לחלקי הרקמה להתייבש בשום שלב.
- תקן את חלקי הרקמה עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 5 דקות.
- שטפו שקופיות ב-PBS במשך 5 דקות.
- חדרו את חלקי הרקמה עם 0.5% Triton-X 100 ב-PBS למשך 15 דקות.
- שטפו שקופיות ב-PBS במשך 5 דקות.
- חסום את הרקמות עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) וסרום עיזים 5% v/v, שניהם ב- PBS (תמיסת חסימה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
הערה: התאימו את סרום התמיסה החוסמת לבעל החיים המארח של הנוגדנים המשניים.
- שטפו שקופיות ב-PBS במשך 5 דקות.
- יש לדגור על מקטעים עם נוגדנים ראשוניים לפי הצורך, אולי גרעין משותף (למשל, DAPI), כלי דם (למשל, CD31) או סמן ציטופלזמי (למשל, אקטין (למשל). כאן, חולדה נגד עכבר CD31 (סמן כלי הדם) בדילול 1:100 שימש על פי הוראות היצרן בתמיסת החסימה בן לילה ב 4 ° C מוגן מפני התייבשות על מגש שקופיות.
הערה: אין להוסיף נוגדן ראשוני או נוגדנים מצומדים נוספים. הצמידות שהוזרקה והורשתה להצטבר ברקמות in vivo פועלת כנוגדן העיקרי.
- שטפו שקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, והחליפו את ה-PBS בכל פעם.
- לדגור שקופיות עם נוגדנים משניים כדי לתייג נוגדנים ראשוניים. עבור יישום זה, דמיינו נוגדן נגד B7-H3 באמצעות נוגדן עז מצומד נגד ארנב AlexaFluor-546 (דילול 1:200, מותאם בהתאם להוראות היצרן) ו- CD31 עם נוגדן משני נגד חולדות עז AlexaFluor-488 (דילול 1:200, מותאם בהתאם להוראות היצרן) בתמיסת חסימה, מוגן מפני אור והתייבשות על מגש שקופיות, למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
הערה: נוגדנים משניים הם מאותה חיה מארחת, אך מתאימים את הזיקה של הנוגדנים המשניים למין המארח של הנוגדן הראשוני המתאים. שקופיות מוגנות מפני אור מנקודה זו ואילך.
- שטפו שקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, והחליפו את ה-PBS בכל פעם.
- יש למרוח טיפה אחת של אמצעי ההרכבה במרכז פרוסת הרקמה ולהניח בזהירות מכסה כדי למנוע לכידה של בועות אוויר.
- אטמו את שולי הכיסוי בלק שקוף והניחו לו להתייבש.
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול למשך עד שבוע בשלב זה, אחסן שקופיות בטמפרטורה של -20°C עד להמשך פעולה.
5. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה כמותי
הערה: הכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי ופרמטרי ההדמיה תהיה תלויה במערכת הקונפוקלית בה נעשה שימוש. המיקרוסקופ המשמש כאן נרכש באופן מסחרי (למשל, Zeiss LSM 510 Meta system) ונעשה שימוש בתוכנת הרכישה הנלווית (למשל, Zen 2009). עם זאת, רבים מצעדים אלה יחולו על כל מיקרוסקופ קונפוקלי ויניחו ידע בסיסי במיקרוסקופ קונפוקלי.
- לאחר הפעלת המערכת והתחממותה, בחר את המטרה הרצויה; כאן נעשה שימוש במטרה של 20x (צמצם מספרי = 0.8).
- טען שקופית בקרה חיובית, coverslip כלפי מטה, כדי לאפשר הגדרת המיטוב עבור האות הבהיר ביותר. הדמיה בערוץ האדום, מקד את המערכת בדגימה במצב הדמיה חיה.
- עבור כל ערוץ לייזר שנעשה בו שימוש, מטב את עוצמת הלייזר, רווח המאסטר וגודל חור הסיכה באופן הבא:
- עבור למצב רציף להדמיה.
- מטב את פסי השקופיות של עוצמת הלייזר (השולטת בעוצמת הלייזר) והרווח (מאסטר) (השולטת במתח עבור צינור מכפיל האור) תוך ניטור ההיסטוגרמה של טבלת חיפוש (LUT). התאם שתי הגדרות אלה עד למילוי הטווח הדינמי של ההיסטוגרמה מבלי להרוות פיקסלים.
הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי, תתרחש הלבנה פוטו. אם הרווח (המאסטר) גבוה מדי, התמונה תהיה רועשת. באופן אידיאלי, הרווח (המאסטר) יהיה באמצע הטווח שלו.
- הגדר את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת (AU), המעניקה את הרזולוציה הגבוהה ביותר ואת פרוסת z הדקה ביותר.
- החלק את פס ההסטה הדיגיטלי כדי למזער את רצפת הרעש בהיסטוגרמה של LUT לקבלת רקע שחור אמיתי.
הערה: לאחר שהגדרות המיקרוסקופ ממוטבות עבור כל ערוץ לייזר ומטרה, שמור אותן קבועות לאורך כל סשן ההדמיה ולהדמיה של כל השקפים, כדי לאפשר השוואה כמותית בין שקופיות.
- תחת הכרטיסיה מצב רכישה, תחת ממוצע, בחר את המספר הרצוי ואת עומק הסיביות. לחץ על הלחצן Optimal כדי להגדיר את גודל הפיקסלים האופטימלי.
- השתמש בלחצן הרכישה 'הצמד' כדי לאסוף תמונה באיכות גבוהה. כאן נבחרו שדות ראייה אקראיים מתוך הגידול, אך תחומי עניין אחרים עשויים לחול על יישומים שונים (כלי דם, שולי גידול, עומק חדירה וכו ')
- שמור קבצי תמונה בפורמט המשמש את תוכנת confocal (כאן, ".lsm") לעיבוד לא מקוון וכימות .
הערה: אם לא כל השקופיות מצולמות במהלך אותה הפעלה, שמור את ההגדרות וטען אותן מחדש בביקורים הבאים, אם כי הדמיה מחדש של אותה שקופית אינה מומלצת עקב הלבנה של תמונות.
- בצע את מדידות עוצמת הפלואורסצנטיות הכמותיות. פתח את פיג'י (Fiji Is Just ImageJ software) וטען קובץ תמונה .lsm על-ידי גרירתו לשורת המצב.
- פצל את נתוני ערוץ הצבע. עבור אל ערימות > תמונות > ערוצים מפוצלים.
- עבד מראש את התמונות הפלואורסצנטיות לפי הצורך, כלומר, החסר את אות הרקע (תהליך > חיסור רקע) או הפחת את הרעש באמצעות שיטת סינון.
- פלח את ערוץ הצבע המתאים לחלבון הייחוס (כתם וסקולרי, גרעיני, תאי) על-ידי קביעת סף על עוצמת האות (Image > Adjust > Threshold).
הערה: סף ידני מכניס סובייקטיביות לניתוח התמונה, ולכן, שימוש באלגוריתם סף אוטומטי או הפניה להיסטוגרמות תמונה הופך את תוצאות ניתוח התמונה לפחות מוטות.
- השתמשו בסף זה ליצירת מסיכה בינארית (Process > Binary > Convert to Mask).
- מדוד ותייג החזר השקעה בתוך המסיכה (נתח > נתח חלקיקים > סמן את הוסף למנהל > אישור).
- החל החזר השקעה על ערוץ הצבע המתאים לנוגדן העניין (לחץ על תמונת ערוץ, נתח כלי > > החזר השקעה מנהל > מדידה). פעולה זו תחיל את החזר ההשקעה של המסיכה על תמונת הנוגדנים ותספק מדידות תמונה עבור מקטעי תווית בחלון תוצאות. החלון Save results (File > Save).
- חשב את הסטטיסטיקה הרצויה של עניין, כגון עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת כמתואר כאן.
- בצע את כל שלבי העיבוד באופן זהה לכל תמונה בקבוצת שקופיות. צור מאקרו כדי לעשות זאת באופן אוטומטי עבור אצוות תמונה גדולות.
- לתצוגת תמונה רק לאחר מדידות כמותיות, החילו התאמות תמונה איכותיות כדי למטב את התצוגה החזותית של תבניות התפלגות ביולוגית על-ידי התאמת המינימום, המקסימום, הבהירות והניגודיות לאותן רמות בכל השקופיות (תמונה > כוונון > בהירות/ניגודיות).
- המירו את סוג התמונה (Image > Type > RGB Color) ושמרו קבצים בסוג תמונה ללא אובדן נתונים, כגון .tiff (File > Save As > Tiff...) לשימוש במצגות ובפרסומים.