מולטיפלקס מבוסס חרוזים לזיהוי נוגדנים ספציפיים לפתוגן ברוק

Abstract

מקור: Augustine, S. A. J., et al. פיתוח נוגדנים מרובים ברוק Immunoassay כדי למדוד את החשיפה האנושית לפתוגנים סביבתיים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים טכניקת בדיקה חיסונית מרובת חרוזים לזיהוי בו זמנית של נוגדנים לפתוגנים סביבתיים מרובים ברוק האנושי. חרוזים פלואורסצנטיים הוצמדו לאנטיגנים מפתוגנים שונים, שנלכדו באמצעות נוגדנים בדגימת הרוק האנושית. לאחר תיוג הנוגדנים באמצעות כתב פלואורסצנטי, החרוזים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים לפתוגן שונים ברוק.

Protocol

1. צימוד חרוזים

1. התאימו את האנטיגנים לערכות החרוזים באמצעות הריכוזים המוצגים בטבלה 1.
2. הוסף כל אנטיגן לחרוזים המופעלים ולהביא את הנפח הכולל ל 500 μl ב 50 mM MES, pH 5.0. מערבבים את האנטיגנים והחרוזים על ידי מערבולת.
3. לדגור על האנטיגנים והחרוזים במשך שעתיים עם ערבוב על ידי סיבוב (~ 15 סל"ד) בטמפרטורת החדר בחושך. משחררים את החרוזים המצומדים על ידי מיקרוצנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 2 דקות.
4. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 500 μl של מלוחים חוצצים פוספט (PBS)-אלבומין בסרום בקר (BSA)-polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween-20)-נתרן אזיד (PBS-TBN) pH 7.4 על ידי מערבולת סוניקציה. משחררים את החרוזים על ידי מיקרוצנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.
   זהירות: נתרן אזיד הוא כימיקל רעיל מאוד. זה קטלני אם נבלע או בא במגע עם העור. אין לנשום אבק/אדים/גז/ערפל/אדים או תרסיס. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPEs) מתאים בעת הטיפול בו והשלכתו בהתאם לחוקים המתאימים.
5. השהה מחדש את החרוזים ב-1 מ"ל של PBS-TBN על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות.
6. מטילים את החרוזים על ידי מיקרו-צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 2 דקות.
7. חזור על שלבים 1.5 ו- 1.6.
   הערה: זה מספק בסך הכל שתי שטיפות עם PBS-TBN.
8. להשהות מחדש את החרוזים המצומדים והשטופים ב 1 מ"ל של PBS, 1% BSA, 0.05% Azide, pH 7.4. אחסנו את החרוזים המצומדים במקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס בחושך.

2. Celevary Multiplex Immunoassay

1. הוציאו את הרוק מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C ואפשרו לו להפשיר בטמפרטורת החדר.
2. השהה מחדש מלאי חרוזים מצומדים לאנטיגן על ידי מערבולת וסוניקציה למשך 20 שניות.
3. הכינו תערובת חרוזים עובדת על ידי דילול מלאי החרוזים המצומדים לריכוז סופי של 100 חרוזים/μl של כל חרוז ייחודי שנקבע במאגר PBS-1% BSA.
4. הכינו דילול רוק ביחס 1:4 עם חיץ PBS-1% BSA בצלחת באר עמוקה בעלת 96 בארות.
5. הרטיבו מראש את צלחת המסנן ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה והוציאו את הסופרנאטנט בוואקום.
6. הוסף 50 μl של תערובת חרוזים עובדת ונפח שווה של רוק מדולל ל -95 בארות של לוחות מסנן 96 בארות עבור דילול סופי 1: 8. מערבבים תגובות עם פיפטור רב ערוצי. לבאר הבקרה האחת, הוסף 50 μl חרוזים מצומדים לאנטיגן בתוספת 50 μl של חיץ PBS-1% BSA (כתחליף לרוק).
7. מכסים ומניחים לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה על שייקר מיקרו-צלחות ב-500 סל"ד. הסר supernatant על ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ כביסה ולהסיר supernatant על ידי ואקום. יש לחזור על הכביסה 1x.
8. להשהות חרוזים ב 50 μl של PBS-1% BSA עם pipettor רב ערוצי.
9. לדלל נוגדן IgG אנטי-אנושי נגד עזים ביוטינילציה ל-16 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS-1% BSA.
10. מוסיפים נוגדן משני מדולל 50 μl לכל באר ומערבבים את התוכן עם פיפטור רב ערוצי.
11. מכסים את צלחת הפילטר ומניחים לה לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant על ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ כביסה ולהסיר supernatant על ידי ואקום. יש לחזור על הכביסה 1x.
12. להשהות חרוזים ב 50 μl של PBS-1% BSA עם pipettor רב ערוצי.
13. יש לדלל סטרפטווידין-R-פיקואריתרין (SAPE) ל-24 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS-1% BSA.
14. מוסיפים 50 μl כתב לכל באר ומערבבים עם פיפטור רב ערוצי.
15. מכסים את צלחת הפילטר ומניחים לה לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant על ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ כביסה ולהסיר supernatant על ידי ואקום. יש לחזור על הכביסה 1x.
16. להשהות חרוזים ב 100 μl של PBS-1% BSA ולנתח 50 μl באמצעות analyzer.
    הערה: תוצאות הבדיקה החיסונית המרובבת נמדדות ביחידות עוצמת פלואורסצנטיות חציונית (MFI). עיין תמיד בגרסה העדכנית ביותר של מדריך התוכנה, אם היא זמינה כדי למנוע שגיאות.

טבלה 1: תערובת חרוזי עבודה עבור האימונואסי המרובה.לאחר השלמת הצימוד והאישור, הוכנה תערובת מאסטר המורכבת מכל ערכת חרוזים כפי שמוצג. תערובת האב חולקה בין כל הבארות בצלחת 96 הקידוחים. כל הבארות הודגרו ברוק, למעט באר בקרת רקע אחת שהכילה רק חרוזים וחיץ PBS-1% BSA.

אנטיגן	סט חרוזים	מאגר צימוד	ריכוז Ag (מיקרוגרם)	# של חרוזים בפינה אחת	# של חרוזים/μl	Vol. עבור 100 B/uL עבור 4 מ"ל (μl)
ג. ג'ג'וני	8	MES 5.0	50	64	6,400	94
ה. פילורי	33	MES 5.0	25	71	7,100	85
הפטיטיס A	42	MES 5.0	100	91	9,100	66
ט. גונדי	30	MES 5.0	25	85	8,500	71
Norovirus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7,200	83
Norovirus GI.1	67	MES 5.0	5	63	6,300	95
ללא צימוד	80	MES 5.0		60	6,000	100
		נפח כולל של חרוזים (μl)				594
		נפח המאגר הכולל הדרוש (μl)				3,406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ציוד ותוכנה
מיקרוצנטריפוגה	חברת תרמו-אלקטרון	75002446	משמש לדגימות צנטריפוגות
מערבול מיקסר	VWR	G560	משמש לערבוב דוגמאות
סוניק (מיני)	פישר סיינטיפיק	15-337-22	משמש להפרדת חרוזים
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	קאפ	מגוון
סעפת ואקום מרובת מסכים	מיליפור	MSVMHTS00	משמש בשלבי שטיפה להסרת סופרנאטנט
מיקרושייקר	VWR	12620-926	משמש להתסיס חרוזים במהלך הדגירות
מדף צינור (1.5 מ"ל ו-0.5 מ"ל) (מגוון)	VWR	30128-346
סולם שקילה	מטלר או אחר		משמש למדידת ריאגנטים לשטיפה להכנת חוצצים
מיקסר לדוגמה Dynabead	Invitrogen	947-01	משמש במהלך שלב הדגירה של הצימוד
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		משמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		משמש לניתוח נתוני תגובת נוגדנים
Luminex Analyzer עם תוכנת xPonent 3.1	חברת לומינקס	LX200-XPON3.1	מכשיר ותוכנה המשמשים להפעלת בדיקה
אנטיגנים
GI.1 Norwalk וירוס : p-particle	שי ג'יאנג (CCHMC)*	נה	* בית החולים לילדים בסינסינטי. קונק סופי. 5 מיקרוגרם.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	שי ג'יאנג (CCHMC)*	נה	* בית החולים לילדים בסינסינטי. קונק סופי. 5 מיקרוגרם.
וירוס הפטיטיס A : כיתה II להתרכז מתרבית תאים	מרידיאן מדעי החיים	8505	אנטיגן מצומד ב 100 מיקרוגרם
הליקובקטר פילורי : ליזט	מרידיאן מדעי החיים	₪1401	אנטיגן מצומד ב 25 מיקרוגרם
Toxoplasma gondii : רקומביננטי p30 (SAG1)	מרידיאן מדעי החיים	₪4426	אנטיגן מצומד ב 25 מיקרוגרם
קמפילובקטר ג'ג'וני : חום הרג תאים שלמים	KPL	50-92-93	אנטיגן מצומד ב 50 מיקרוגרם
נוגדנים ראשוניים
שרקן גינאה אנטי-נורו-וירוס	(CCHMC)*	נה	משמש לאישור צימוד
עכבר נגד הפטיטיס A IgG	מרידיאן מדעי החיים	C65885M	משמש לאישור צימוד
עכבר נגד הפטיטיס A IgG	מרידיאן מדעי החיים	C65885M	משמש לאישור צימוד
נוגדן מטוהר BacTraceAffinity להליקובקטר פילורי	KPL	01-93-94	משמש לאישור צימוד
pAb עיזים ל Toxoplasma gondii	אבקאם	AB23507	משמש לאישור צימוד
BacTrace מינים אנטי-קמפילובקטר של עזים	KPL	01-92-93	משמש לאישור צימוד
נוגדנים משניים
Biotin-SP-מצומד AffiniPure Donkey נגד עיזים IgG (H+L)	ג'קסון	705-065-149	משמש לאישור צימוד
ארנב Biotinylated נגד עיזים IgG (H+L)	KPL	16-13-06	משמש לאישור צימוד
IgG נגד עכבר עז Biotinylated (H+L)	KPL	16-18-06	משמש לאישור צימוד
זיקה נוגדן מטוהר ביוטין שכותרתו עז נגד ארנב IgG (H+L)	KPL	176-1506	משמש לאישור צימוד
זיקה נוגדן מטוהר ביוטין שכותרתו IgG אנטי-אנושי עז(γ)	KPL	16-10-02	משמש עבור Immunoassay רוק
חומרים מתכלים
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות קופולימר	ארה"ב סיינטיפיק	1415-2500	משמש צינורות מיקרוצנטריפוגות קשירה נמוכה
10 μL מילוי קצה פיפטה	ביו-ונצ'רס	5030050ג
200 μL מילוי קצה פיפטה	ביו-ונצ'רס	5030080ג
1000 μL מילוי קצה פיפטה	ביו-ונצ'רס	5130140ג
רדיד אלומיניום	ספקים שונים		משומש לשמור חרוזים בחושך במהלך הדגירות
צלחות באר עמוקה	VWR	40002-009	משמש לדילול דגימות רוק
לוחות סינון מרובי מסכים	מיליפור	MABVN1250	משמש להפעלת בדיקות
מערכת איסוף רוק של Oracol	Malvern פיתוחים רפואיים מוגבלת		משמש לאיסוף רוק
ריאגנטים
מיקרוספרות קרבוקסיליות (חרוזים)	חברת לומינקס	תלוי בערכת חרוזים	אנטיגנים מצומדים למיקרוספרות
EDC (1-אתיל-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	פירס	77149 או 22980	משמש בהפעלת חרוזים
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	פירס	24510	משמש בהפעלת חרוזים
סטפטווידין-R-פיקואריתרין (1 מ"ג/מ"ל)	בדיקות מולקולריות	S-866	משמש ככתב
MES (2-[N-Morpholino]חומצה ethanesulfonic)	סיגמא	M-2933	משמש לצימוד
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	סיגמא	P-9416	משמש במאגר כביסה להסרת כריכה לא ספציפית
מאגרי חלבון
PBS-TBN חסימה/מאגר אחסון (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C
PBS, pH 7.4	סיגמא	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	סיגמא	A-7888	0.1% (עם V/V)
טווין-20	סיגמא	P-9416	0.2% (V/V)
נתרן אזיד (0.05% אזיד)**	סיגמא	S-8032	**זהירות: נתרן אזיד הוא רעיל מאוד. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. לבשו ציוד הגנה אישי מתאים. יש להשליך בהתאם לחוקים החלים.
MES/ מאגר צימוד (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]חומצה ethanesulfonic)	סיגמא	S-3139
5 N NaOH	פישר	SS256-500
מאגר Assay (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	סיגמא	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
מאגר הפעלה (0.1 מטר NaH2PO4, pH 6.2)			יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C
NaH2PO4 (נתרן פוספט, מונובייסיק נטול מים)	סיגמא	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	פישר	SS256-500
חיץ כביסה (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			יש לסנן, לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C
PBS, 0.05% טווין-20, pH 7.4	סיגמא	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN