מדידה ציטומטרית של זרימה כמותית של פגוציטוזה של נבגים פטרייתיים על ידי פגוציטים אנושיים

תקציר

מקור: Hartung, S., et al., מדידת פגוציטוזה של Aspergillus fumigatus Conidia על ידי לויקוציטים אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים שיטה לכימות הפאגוציטוזה של נבגי פטריות פתוגניים המסומנים בתווית FITC על ידי לויקוציטים אנושיים. נבגים פגוציטוזים מובחנים מנבגים הנצמדים לתאים באמצעות צביעה נגדית, ולאחר מכן ניתוח ציטומטרי של זרימה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בדיקת פגוציטוזה

1. לדגור 2 x 10⁶ לויקוציטים ו 4 x 10⁶ קונידיה מסומנת FITC (ריבוי זיהום = 2) ב 1.5 מ"ל של RPMI + 10% FCS בצלחת תרבית תאים 12 באר. כפקדים, כלול תאים בלבד (ללא conidia) ותאים + conidia ללא תווית.
2. יש להניח באינקובטור CO₂ לח בטמפרטורה של 37°C ולדגור למשך פרק הזמן הרצוי (למשל, 0.5 שעות, שעתיים או 4 שעות).
3. לאחר הדגירה, לקצור תאים עם מגרד תאים ולשים צינור 15 מ"ל.
4. סבבו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם בטמפרטורת החדר.
5. לאסוף supernatant עבור ניתוח ציטוקינים או לזרוק אם לא רצוי. השהה מחדש כל דגימה ב 100 μL של PBS + 2 mM EDTA.

2. צביעת נוגדנים

1. עבור כל דגימה, הכינו 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים, כולל נוגדן APC נגד FITC, לפי טבלה 1.
2. שים דגימה של 100 μL לתוך באר אחת של צלחת V תחתונה 96 באר. הוסף 150 μL של PBS + 2 mM EDTA לכביסה.
3. לפיצוי צבע, מקמו 1 x 10⁶ תאים לכל צבע בבארות נוספות של הלוח התחתון V של 96 בארות. כלול באר של תאים שנותרה לא מוכתמת. הוסף 150 μL של PBS + 2 mM EDTA לכביסה.
4. מכסים את הצלחת בנייר כסף דביק.
5. סבבו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם בטמפרטורת החדר. הסירו את נייר הכסף.
6. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך מהיר וחזק של הצלחת רק פעם אחת מעל הכיור או עם מגבת נייר חד פעמית.
   הערה: אין לחזור על הפעולה או לדפוק את הצלחת על נייר עד לייבוש, שכן הדבר יגרום לאובדן מסיבי של תאים מהצלחת.
7. להשהות תאים בתערובת נוגדנים 100 μL, ולערבב היטב על ידי pipetting.
8. לפיצוי צבע, להשעות מחדש את התאים המתאימים ב 100 μL של PBS + 2 mM EDTA ולהוסיף נוגדן יחיד לכל באר באותה כמות המשמשת בתערובת נוגדנים.
9. מכסים בנייר כסף ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
10. הסירו את נייר הכסף. הוסף 150 μL של PBS + 2 mM EDTA לכל באר לשטיפה. מכסים ברדיד אלומיניום.
11. סבבו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם בטמפרטורת החדר. הסירו את נייר הכסף. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך מהיר וחזק של הצלחת מעל הכיור או מגבת נייר חד פעמית.
12. השהה מחדש ב 200 μL של PBS + 2 mM EDTA ולהעביר תאים מכל באר לצינור תחתון עגול נפרד. ודא שאין אשכולות תאים בהשעיה. הסר אשכולות אחרת.
    הערה: כל צביר גדול מספיק כדי שהעין תוכל לראות הוא גדול מספיק כדי לסתום את הציטומטר.

3. ציטומטריית זרימה

1. הפעל את ציטומטר הזרימה ותן לו להתחמם. הפעל את תוכנת הרכישה.
2. צור ניסוי חדש והגדר ותייג את הדגימות.
3. הגדר פרמטרים (FSC 250, SSC 250) וגלאים עבור פלואורופורים FITC, APC, BUV395, V500 ו- PerCP-Cy5.5.
4. הגדרת פיצוי
   1. הגדרת פיצוי פתוחה.
   2. ציין צבעים בודדים.
   3. באמצעות תאי הבקרה שנותרו ללא כתמים או עם כתמים בודדים, הגדר את מתחי גלאי PMT כך שיכללו את כל האירועים בסולם.
   4. תעד לפחות 10,000 אירועים של כל פקד.
   5. השתמש בהגדרת הפיצוי כדי לחשב את זליגת הפלואורופורים ולהחיל אותה על הגדרות הציטומטר של הניסוי.
5. רישום נתונים לדוגמה
   1. הצג FSC ו- SSC בתוכנת הרכישה והגדר שער סביב לויקוציטים.
   2. בהתבסס על שער לויקוציטים, הציגו את תרשים הנקודות SSC/CD45 ואת השער עבור תאי CD45⁺ כדי להיפרד מקונידיה.
   3. הצג תאי CD45⁺ בתרשים נקודה CD14/CD66b ומונוציטים שער (CD14⁺) ונויטרופילים (CD66b⁺) בנפרד.
   4. הצגת נויטרופילים בתרשים נקודה אנטי-FITC/FITC.
   5. באמצעות הדגימה עם conidia ללא תווית, הגדר רבעים עבור אותות anti-FITC ו- FITC, המאפשר מקסימום של 1% מהתאים ברבעים המתאימים.
   6. חזור על שלבים 3.5.4 ו- 3.5.5 עבור שער המונוציטים.
   7. רשום את כל הדגימות עם לפחות 20,000 אירועים בשער לויקוציטים.

טבלה 1: תערובת נוגדנים לציטומטריית זרימה. כמויות של כל מגיב ניתנות כמיקרוליטרים לדגימה (1 x 10⁶ תאים) לניתוח.

מגיב	μl לדגימה
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0.5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
נגמ"ש נגד FITC	0.5
PBS + 2 mM EDTA	97
סך	100

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רדיד אלומיניום	מותג	701367
צלחת תרבית תאים, 12 בארות	גריינר ביו-וואן	665180
ציטומטר	BD Biosciences		LSR Fortessa II, לייזרים: 488 ננומטר (כחול), 405 ננומטר (סגול), 355 ננומטר (UV) ו-640 ננומטר (אדום)
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	סיגמא אולדריץ'	ED3SS-500g	2 מ"מ ב-PBS
פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)	סיגמא אולדריץ'	F3651-100MG	0.1 mM בפתרון Na2CO3 /PBS
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמופישר סיינטיפיק	189012-014	ללא סידן, ללא מגנזיום
RPMI 1640	תרמופישר סיינטיפיק	61870010	RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX
תוכנה לרכישה וניתוח נתונים	BD Biosciences
צלחת תחתונה V, 96 באר	מותג	781601	משטח לא מטופל
פורמלדהיד	קרל רות'	PO87.3	היסטופיקס