בדיקת אימונופלואורסנציה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים

תקציר

מקור: Aulas, A. et al., שיטות לסיווג מוקדים ציטופלזמיים כגרגרי עקה של יונקים.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים בדיקה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים, המורכבים מ-mRNAs, חלבונים קושרי RNA (RBPs) וחלבונים שונים אחרים.

פרוטוקול

1. הכנת תאים

1. הוסיפו פתקי כיסוי אוטומטיים ל-12 בארות של צלחת בת 24 בארות, כפי שמצוין באיור 1A; ניתן לעשות זאת באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר המחוברת לוואקום כדי להרים כל כיסוי. טפחו בעדינות על המכסה בצד הבאר כדי לשחרר את היניקה, ואפשרו למכסה ליפול לתוך הבאר.
2. צלחת 1 x 10⁵ U-2 OS (U2OS) תאי אוסטאוסרקומה לכל באר בנפח סופי של 500 μL של בינוני. הזז את הצלחת מצד לצד ולמעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה.
3. לחץ בעדינות על החלקות הכיסוי כלפי מטה עם קצה P1000 נקי כדי לוודא שהמכסה נמצא בתחתית הבאר ושאין בועות מתחת למכסה הכיסוי.

2. תאי סטרס

1. למחרת, בדקו ויזואלית את הצלחת כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה ומשתלבים באופן שווה על פני הכיסוי, מכיוון ששינויים בין הדגימות עלולים להשפיע לרעה על יכולת השחזור של התוצאות. השתמש במטרה פי 10 במיקרוסקופ הפוך של תרבית רקמה.
2. מחממים את המדיום ל-37°C. הימנעו מהחלת מדיה קרה או חמה על התאים, שכן אלה גורמים להלם קר או להלם חום, בהתאמה.
3. לדלל תרופות במדיה מחוממת מראש. עבור כל ריכוז תרופה שונה, להכין 2 בארות המכילות 500 μL של בינוני. הכינו 500 μL נוספים כדי לאפשר אובדן בזמן הצנרת. Aliquot 4 צינורות, כל אחד מכיל 1.5 מ"ל.
   1. עבור נתרן ארסניט: לכל באר המכילה 500 μL, להוסיף 1.5 μL של 100 mM נתרן ארסן (ריכוז סופי: 100 μM) או להוסיף 0.75 μL של 100 mM נתרן ארסן (ריכוז סופי: 50 μM).
   2. עבור וינורלבין: לכל באר המכילה 500 μL, הוסף 22.5 μL של 10 mM vinorelbine (ריכוז סופי: 150 μM) או הוסף 18.75 μL של 10 mM vinorelbine (ריכוז סופי: 100 μM).
      הערה: נתרן ארסן הוא גורם גרגרי מאמץ מאופיין היטב ונפוץ ולכן משמש באופן קלאסי כבקרה חיובית.
4. הסר והשלך את המדיה מבארות B1 - 4 ו- C1 - 4. הוסיפו את המדיה עם סמים וחכו 60 דקות (איור 1A).
   1. הוסף 500 μL של בינוני עם 100 μM נתרן ארסניט בארות B1 ו B2. הוסף 500 μL של בינוני עם 50 מיקרומטר נתרן ארסן בארות B3 ו B4.
   2. הוסף 500 μL של בינוני עם 150 מיקרומטר vinorelbine בארות C1 ו C2. הוסף 500 μL של בינוני עם 125 מיקרומטר vinorelbine בארות C3 ו C4.
5. 30 דקות לפני הקיבוע, יש לטפל בבארות בטור 2 עם 5 מיקרוליטר ציקלוהקסימיד (1 מ"ג/מ"ל מלאי) ובבארות בטור 4 עם 2 מיקרוליטר פורומיצין (1.25 מ"ג/מ"ל מלאי). נענעו בעדינות את הצלחת כדי לערבב לפני שתחזירו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

3. קיבוע תאים ואימונופלואורסנציה

הערה: לפני הניסוי, ודא שהמתנול מקורר ל -20 ° C. צור חוצצים, כולל מלוחים חוצצי פוספט (PBS), 5% סרום סוסים רגיל (NHS) ב- PBS, ו- 4% פרפורמאלדהיד (PFA) ב- PBS.

1. השליכו את המדיה ושטפו את הבארות המכילות כיסויים עם PBS. בהתאם לתרופות המשמשות, ייתכן שיהיה חשוב להשליך כראוי את התרופות המכילות מדיה; צור קשר עם המשרד המקומי לבטיחות סביבתית לקבלת הוראות ספציפיות. כדי לשטוף ביעילות, מלאו בקבוק לחיץ ב-PBS, חתכו את הקצה כדי לאפשר זרימה עדינה ולא זרם הדוק, והשתמשו בו כדי להוסיף PBS לכל באר לאחר שאיפת PBS המקורי.
2. תקן את התאים באמצעות ~ 250 μL של 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, RT תחת תסיסה עדינה. לכסות לחלוטין את החלק העליון של הכיסוי עם PFA; 250 μL אמור להספיק, אבל אם לא, להוסיף עוד. הימנעו תמיד מפיפט ישירות על הכיסויים, מכיוון שתאים מסוימים (או טיפולי לחץ של תאים) יכולים לשנות את ההתקשרות, והכוח מהצנרת יכול לעקור את התאים.
3. הסר את ה- PFA והשלך כראוי. צור קשר עם המשרד המקומי לבטיחות סביבתית לקבלת פרטים כיצד להשליך כראוי paraformaldehyde.
4. הוסף ~ 250 μL מתנול (-20 ° C) ודגר במשך 5 דקות ב RT תחת נדנוד עדין; זה גם מחלחל וגם משטיח את התאים.
5. הסר והשלך את המתנול וחסום את התאים על ידי החלת ~ 250 μL של 5% NHS למשך שעה אחת ב- RT לילה, O/N, ב 4 ° C. צור קשר עם המשרד המקומי לבטיחות הסביבה לקבלת פרטים כיצד להשליך מתנול כראוי.
6. עבור נוגדנים ראשוניים, לדלל את הנוגדנים ב 5% NHS.
   הערה: השימוש בסמני SG מרובים הוא המפתח לאישור אם הגרגירים שנצפו הם SGs בתום לב. מספר סמני SG שניתן להשתמש בהם תלוי במסננים הזמינים במיקרוסקופ. אם ערכות מסננים סטנדרטיות בירוק, אדום ואדום רחוק זמינות, השתמש ב- G3BP1, eIF4G ו- eIF3b בדילול של 1/250.
   1. עבור ניסוי זה (12 כיסויים ב 250 μL כל אחד-סה"כ: 3 מ"ל של 5% NHS), להוסיף 12 μL של כל אחד מהבאים: anti-G3BP1, anti-eIF3b, ו anti-eIF4G. לדגור על הנוגדנים הראשוניים באמצעות תסיסה עדינה לפחות 1 שעה ב RT או O/N ב 4 ° C.
7. שטפו את הבארות 3x עם PBS, ודגרו על כל שטיפה במשך 5 דקות.
8. עבור נוגדנים משניים, לדלל את כל הנוגדנים המשניים (דילול 1/250) ואת צבע Hoechst (דילול 1/1,000) ב 5% NHS.
   1. עבור ניסוי זה (12 כיסויים ב 250 μL כל אחד-סה"כ: 3 מ"ל של 5% NHS), להוסיף 12 μL של כל אחד מהבאים: Cy2-עכבר, Cy3-Rabbit, ו Cy5-עז (דילול 1/250 של כל אחד) ולהוסיף 3 μL של צבע Hoechst.
   2. לדגור על הכיסויים עם הנוגדנים המשניים במשך שעה אחת ב- RT. במהלך שלב זה והשלבים הבאים, להגן על הדגימות מפני אור על ידי כיסוי הצלחת עם קופסה או על ידי הנחת נייר כסף על החלק העליון של צלחת תרבית רקמה.
9. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
10. הרכיבו את הכיסויים על שקופיות זכוכית מסומנות באמצעות אמצעי הרכבה. מחממים את מדיום ההרכבה בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; זה מקטין את הצמיגות ומקל על פיפטה. עם קצה P200 חתוך, פיפטה 25 μL של אמצעי הרכבה לכל כיסוי להחליק על מגלשת זכוכית; 4-8 כיסויים יכולים להתאים למגלשת זכוכית אחת, בהנחה ששלב המיקרוסקופ מאפשר זאת. בעזרת מלקחיים עדינים, מעבירים את המכסה מהבאר למגלשה, ודואגים להניח את צד התא על אמצעי ההרכבה. באמצעות קצה P200 נקי, לחץ על הכיסוי כלפי מטה.
11. לאחר התקנת כל הכיסויים, השתמש ברקמת מעבדה מקופלת כדי לנקות את אמצעי ההרכבה העודפים על ידי לחיצה חזקה מאוד על רקמת המעבדה על המגלשה. השתמש בבקבוק לחיץ המכיל H₂O כדי לשטוף את אמצעי ההרכבה העודפים ולאחר מכן חזור על הכתמים עם רקמת מעבדה מקופלת כדי להסיר את המים.

תוצאות

איור 1: דיאגרמות ניסיוניות. (A) תאי זרע על גבי כיסויים שהונחו קודם לכן בצלחת בת 24 בארות, כפי שצוין. יש לטפל בשורות A ו-B במשך 60 דקות עם SA או VRB תוך שימוש בריכוז ב-μM כפי שצוין. לאחר 60 דקות, הוסף CHX (ריכוז סופי: 20 מיקרוגרם/מ"ל עבור עמודה 2) או פורו (20 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין עבור עמודה 4) למדיום המכיל תרופה. יש להמשיך את הדגירה במשך 30 דקות נוספות לפני הקיבוע וההכתמה. (...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת ההפעלה U-2	ATCC	ATCC®HTB-96™	- נכתב בדרך כלל כ-"U2OS" - תרבית ב 37 ° C תחת 5% CO2 ב 10% FBS/DMEM
השינוי של דולבקו למדיום הנשר	קורנינג	10-013-CV	- DMEM - מכיל 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, פירובט, פנול red - בתוספת 10% FBS, 10 mM HEPES, ופניצילין/סטפטומיצין - דילול מוקדם של תרופות - דילול טרום חם של תרופות קודמות
סרום בקר עוברי	סיגמא	F2442-500 מ"ל	- FBS - משמש להשלמת מדיה
HEPES (1 מטר)	תרמו פישר סיינטיפיק	15630-080	- משמש להשלמת מדיה
פניצילין סטרפטומיצין	סיגמא	P0781-100 מ"ל	- משמש להשלמת מדיה
24 צלחת באר	כוכב משנה	3524
רקמות מעבדה	קימטק סיינס	34120	- נקרא בדרך כלל "kimwipes"
זכוכית כיסוי למשקפי כיסוי צמיחה	פישר סיינטיפיק	12-545-82	- autoclaved לפני השימוש - לשמור סטרילי במכסה המנוע של תרבית הרקמה
נתרן (מטה)ארסניט ≥90%	סיגמא	S7400-100G	- נקרא בדרך כלל נתרן ארסניט ומקוצר SA - המסה במים בריכוז 1 M, ולאחר מכן לדלל ל 100 מיקרומטר כמלאי עבודה
ונוראלבין	TSZ CHEM	RS055	- VRB - להתמוסס במים עד 10 mM
פורומיצין	סיגמא	P9620	- משמש להערכת רמת התרגום (ribopuromycylation) - משמש להערכת קשר SG עם תרגום פעיל - לדלל במים עד 10 מ"ג/מ"ל
אמטין דיהידרוכלוריד הידרט	סיגמא	E2375	- משמש בשילוב עם PURO להערכת רמת תרגום כללית - משמש להערכת קשר SG עם תרגום פעיל - לדלל במים עד 10 מ"ג/מ"ל
ציקלוהקסימיד	סיגמא	C4859	- CHX - משמש להערכת קשר SG עם תרגום פעיל - לדלל במים עד 10 מ"ג/מ"ל
פוספט חוצץ מלוחים	לונזה / VWR	95042-486	- PBS - חיץ שטיפה לאימונופלואורסנציה
כיתה מגיב Paraformaldehyde, גבישי	סיגמא	P6148-500G	- הכינו תמיסה של 4% ב-PBS חם במנדף, ערבבו עד להמסה - aliquots ניתן לאחסן ב - 20 °C למשך מספר חודשים - מסוכן, להשתמש אוורור - השלכה לפסולת מיוחדת
מתנול, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- מקורר מראש ל-20°C לפני השימוש - השלכה לפסולת מיוחדת
סרום סוסים רגיל	תרמו פישר סיינטיפיק	31874	- מקוצר NHS - לדלל ל-5% ב-PBS - להוסיף סודיום אזיד לאחסון ב 4°C - פתרון חוסם עבור immunofluorescence
אתנול, טהור, הוכחה 200 (100%),USP, KOPTEC	מעבדות דקון / VWR	89125-188	- לדלל עד 70% עם מים
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus של Fisherbrand	פישרברנד	12-550-15
עכבר נוגדן נגד G3BP1 (TT-Y)	סנטה קרוז	SC-81940	- יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C - יש להשתמש בדילול של 1/100
נוגדן ארנב נגד eIF4G (H-300)	סנטה קרוז	SC-11373	- יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C - דילול 1/250
נוגדן עיזים נגד eIF3η (N-20)	סנטה קרוז	SC-16377	- eIF3η ידוע גם בשם eIF3b - יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C - דילול 1/250
Cy2 AffiniPure חמור נגד עכבר IgG (H+L)	ג'קסון אימונוריסרץ'	715-225-150	- יש להחזיר למים בהתאם להוראות היצרן ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של 4°C - דילול 1/250
Cy3 AffiniPure חמור נגד ארנב IgG (H+L)	ג'קסון אימונוריסרץ'	711-165-152	- יש להחזיר למים בהתאם להוראות היצרן ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של 4°C - דילול 1/2500
Cy5 AffiniPure חמור נגד עיזים IgG (H+L)	ג'קסון אימונוריסרץ'	705-175-147	- יש להחזיר למים בהתאם להוראות היצרן ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של 4°C - דילול 1/250
פתרון Hoechst 33258	סיגמא	94403-1 מ"ל	- לדגור עם נוגדנים משניים - תמיסת מלאי 0.5 מ"ג / מ"ל ב dH20, להגן מפני אור - לאחסן ב 4 ° C
20 x מאגר SSC	Thermo fisher Ambion	AM9763	- לדלל ל-2X SSC באמצעות מים נטולי RNase (מטופלים ב-DEPC)- יש לאחסן בטמפרטורת החדר- לשטוף חיץ לדגים
מדיה להרכבה על שקופיות	תוצרת בית	/	- לערבב 5 גרם של פולי "מסיס קר" (ויניל אלכוהול) ב 20 מ"ל של PBS- לערבב על ידי סוניקציה, ולאחר מכן ערבוב לילה ב RT- להוסיף 5 מ"ל של גליצרול ו 0.2 מ"ל של 20% נתרן אזיד, ולערבב במשך 16 שעות ב RT- צנטריפוגה ב 20,000 גרם במשך 20 דקות, להשליך גלולה גדולה- נוזל צמיג aliquot, אחסון לטווח ארוך ב-20°C-, שבוע אחד ב-4°C
Parafilm "M"	סיגמא	P7793-1EA	- מכונה בדרך כלל "Parafilm"
פולי (אלכוהול ויניל)	סיגמא	P-8136-250G	- מגיב להכנת וינול
גליצרול	סיגמא	G5516-100ML	- מגיב להכנת וינול
נתרן אזיד	פישר סיינטיפיק	S2002-5G	- חומר משמר לתמיסת חסימה ווינול - לבצע דילול של 20% במים