כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת המבחן
- לאסוף, להכין ולארגן את החומרים שצוינו עבור ההליך (עיין בטבלת חומרים/ציוד ספציפיים).
- תווית צינורות 12 x 75 מ"מ.
- תייגו שתי שפופרות עבור כל משתתף: צינורית אחת עבור בדיקת פאגוציטוזה (תייגו צינור זה בדיו שחור ו-"F" עבור איזותיוציאנט פלואורסצאין [FITC]) וצינורית אחת עבור בדיקת הפעילות של פרץ חמצון (OB) (תייגו צינור זה בדיו אדום ו-"H" עבור דיהידרואתידיום [HE]).
הערה: מומלץ להשתמש בצינורות סטריליים בגודל 12 x 75 מ"מ כדי למזער הפעלה סלולרית לא מכוונת ועלייה נלווית ברעשי רקע.
- תייגו שלוש שפופרות עבור פקדי הבדיקה: צינורית אחת עבור בדיקת הפאגוציטוזה (בקרת FITC: תייגו צינור זה בדיו שחור ו- "F"), צינור אחד עבור בדיקת פעילות OB (בקרת HE: תייגו צינור זה בדיו אדום ו- "H"), וצינור אחד עבור הבקרה השלילית (דם בלבד: תייגו צינור זה בדיו ירוק ו"דם בלבד").
- הכינו תמיסות מלאי לפחות יום לפני יום הבדיקה.
- הכינו את המלח הסטרילי חוצץ הפוספט (PBS). לדלל 100 מ"ל של 10x PBS עם 900 מ"ל של 18.2 MΩ H2O. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- הכינו את הגלוקוז הסטרילי של PBS. להמיס 1.0 גרם של גלוקוז ב 100 מ"ל של PBS. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- הכינו את חיץ הציטראט הסטרילי באורך 0.1 מ'. להמיס 1.2 גרם של חומצת לימון ו 1.1 גרם של ציטראט נתרן ב 100 מ"ל של 18.2 MΩ H2O. להתאים את ה- pH ל 4.0. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- הכן את פתרון המניות של HE. Resuspend 1.0 מ"ג של HE ב 1.0 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO). יש לערבב בעדינות, לערבב ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- הכינו את תמיסת הסטוק Staphylococcus aureus (S. aureus) עם תווית FITC (2 x 10,9 חלקיקים/מ"ל). יש להשהות 10 מ"ג של S. aureus עם תווית FITC ב-1.5 מ"ל (או כמות מתאימה) של PBS. מחלקים לשלושה אליציטוטים של 500 μl וסוניקט בהתאם להמלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
- הכינו את תמיסת הסטוק S. aureus ללא תווית (2 x 109 חלקיקים / מ"ל). להשהות 100 מ"ג של S. aureus ללא תווית ב 15 מ"ל (או כמות מתאימה) של PBS. מחלקים לשלושים 500 μl aliquots ו sonicate על פי המלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
- הכינו פתרונות עבודה טריים ביום הבדיקה.
- הכן את פתרון העבודה של HE. העבר 10 μl של תמיסת מלאי HE מופשרת ל 990 μl של PBS-גלוקוז. יש להגן מפני אור ולשמור על קרח עד לשימוש.
- הכן את פתרון העבודה S. aureus המסומן בתווית FITC (133,333 חלקיקים/μl). העבר 70 μl של תמיסת מלאי S. aureus מופשרת עם תווית FITC ל- 980 μl של PBS. יש להגן מפני אור ולשמור על קרח עד לשימוש.
- הכינו את תמיסת העבודה S. aureus ללא תווית (133,333 חלקיקים / μl). העבר 70 μl של תמיסת מלאי S. aureus מופשרת ללא תווית ל- 980 μl של PBS. יש להגן מפני אור ולשמור על קרח עד לשימוש.
- הכינו את תמיסת המרווים. הוסף 750 μl של 0.4% תמיסה כחולה טריפאן ל 11.25 מ"ל של חיץ ציטראט סטרילי 0.1 M. יש לשמור באמבט עם מי קרח עד לשימוש.
- בקשו מפלבוטומיסט מוסמך לשאוב דם בהתאם להנחיות ארגון הבריאות העולמי ללקיחת דם.
- יש לשאוב דם לתוך צינורית איסוף דם אחת של 4 מ"ל המכילה חומצה דיפוטסיום אתילאנדיאמין טטראצטית (K2EDTA). הפוך את צינורית איסוף הדם בהתאם להוראות היצרן. יש לשמור את צינורית איסוף הדם בטמפרטורת החדר על נדנדה על ספסל עד לשימוש. השתמש בדם זה לספירת הדם המלאה (CBC) עם ניתוח דיפרנציאלי של תאי דם לבנים (WBC) המתואר בשלב 1.2.1.
- יש לשאוב דם לתוך צינורית איסוף דם אחת של 4 מ"ל המכילה ליתיום הפרין. הפוך את צינורית איסוף הדם בהתאם להוראות היצרן. יש לשמור את צינורית איסוף הדם בטמפרטורת החדר (RT) על נדנדה על ספסל עד לשימוש. השתמש בדם זה עבור מונוציטים וגרנולוציטים phagocytosis ו OB פעילות הבדיקה המתוארת בשלב 2.
- לקבוע את כמות החיידקים (כלומר, S. aureus) כי יהיה צורך להשלים את הבדיקה עבור כל דגימה.
- השתמש במנתח המטולוגי כדי לבצע CBC עם ניתוח דיפרנציאלי WBC על הדם כמתואר בהוראות היצרן. רשום לעצמך את ספירת WBC (בתאים/מ"ל), % נויטרופילים וערכי %מונוציטים.
- השתמש במשוואות הבאות כדי לקבוע את ספירת הנויטרופילים והמונוציטים עבור כל דגימה.
ספירת נויטרופילים (בתאים/מ"ל) = %נויטרופילים × WBC (בתאים/מ"ל)
ספירת מונוציטים (בתאים/מ"ל) = %מונוציטים × WBC (בתאים/מ"ל)
- השתמש במשוואות הבאות כדי לקבוע את ספירת הפאגוציטים עבור כל דגימה ואת מספר הפאגוציטים הנמצאים ב- 100 μl של הדגימה.
ספירת פגוציטים (בתאים/מ"ל) = ספירת נויטרופילים (בתאים/מ"ל) + ספירת מונוציטים (בתאים/מ"ל)
מספר הפאגוציטים ב-100 μl = (ספירת פגוציטים (בתאים/מ"ל))/10
- השתמש במשוואה שלהלן כדי לקבוע את מספר החיידקים (כלומר, S. aureus) הדרושים לכל דגימה ואת כמות תמיסת העבודה S. aureus או S. aureus ללא תווית FITC (133,333 חלקיקים / מ"ל) שיש להוסיף לכל צינור.
הערה: יחס חיידקי היעד: פגוציטים הוא 8:1.
מספר החיידקים הדרושים = מספר הפאגוציטים ב-100 μl × 8
נפח FITC או פתרון עבודה ללא תווית הדרושים (ב μl) = (מספר החיידקים הדרושים)/(133,333 חלקיקים / μl)
2. ביצוע בדיקה
- הכינו דם שלם לבדיקה.
- עבור כל משתתף וצינור ביקורת, השתמש בקצה פיפטה באורך מורחב כדי להעביר 100 μl של דם שלם מצינורית איסוף הדם ליתיום הפרין לתחתית צינור מסומן כראוי 12 x 75 מ"מ. החלף caps.
הערה: היזהר כדי למנוע קבלת דם על הצדדים של צינורות 12 x 75 מ"מ.
- השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף 10 μl של תמיסת עבודה HE לצינורות המסומנים בדיו אדום ו- "H", כולל צינור הבקרה HE. יש להחליף את הפקקים והמערבולות לזמן קצר.
- יש לדגור על כל הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו מיד את כל הצינורות לאמבט מי קרח למשך 12 דקות
הערה: השתמש במתלה מתכת פתוח ונער בעדינות את המדף כל 5 דקות כדי להבטיח שהצינורות מחוממים או מקוררים במהירות ובהקפה.
- הוסף חיידקים (כלומר, S. aureus) לדגימה ולצינורות הבקרה.
- השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף את הכמות המתאימה (המחושבת בשלב 1.2.4) של תמיסת עבודה S. aureus ללא תווית לצינורות המסומנים בדיו אדום ו- "H", כולל צינור הבקרה HE. יש להחליף את הפקקים והמערבולות לזמן קצר.
- השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף את הכמות המתאימה (המחושבת בשלב 1.2.4) של פתרון העבודה S. aureus המסומן בתווית FITC לצינורות המסומנים בדיו שחור ו- "F", כולל צינור הבקרה FITC. יש להחליף את הפקקים והמערבולות לזמן קצר.
- מערבלים את צינור הבקרה "דם בלבד", אך אינם מוסיפים אליו אף אחד מסוגי החיידקים (כלומר, S. aureus).
- יש לדגור על כל הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. יש להשתמש במתלה מתכת פתוח ולנער בעדינות את המדף כל 5 דקות כדי להבטיח חימום מהיר והולם. לאחר תקופת הדגירה, להעביר מיד את כל הצינורות לאמבט מי קרח למשך דקה אחת.
- לשטוף את התאים.
- השתמש פיפטה מהדר כדי להוסיף 100 μl של תמיסת מרווה קרה כקרח לכל הצינורות. החליפו מכסים, מערבלים לזמן קצר, ולאחר מכן דגרו על כל הצינורות על קרח למשך דקה אחת.
- השתמש פיפטה מהדר כדי להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל הצינורות. מערבלים לזמן קצר, ולאחר מכן מוסיפים 2 מ"ל נוספים של PBS קר כקרח לכל הצינורות ומחליפים מכסים. צנטריפוגה את כל הצינורות במשך 5 דקות ב 4 ° C ו 270 x גרם, ולאחר מכן לשאוף את supernatant.
- חזור על שלב 2.3.2 פעם אחת (סה"כ 2 כביסות).
- הכינו דוגמאות לציטומטריית זרימה.
- השתמש פיפטה משחזר להוסיף 50 μl של סרום בקר עוברי קר כקרח לכל הצינורות. מערבול קצר כל הצינורות.
- העבר את כל הצינורות לקרוסלה מתאימה והשתמש בתחנת עבודה אוטומטית להכנת ליז תאים עם ריאגנטים לקיבוע תאי דם אדומים (RBC) וריאגנטים לתיקון WBC כדי לשקר את ה- RBCs ולתקן את ה- WBCs כמתואר בהוראות היצרן.
