כימות רמות המתווך החיסוני בנוזל רירית האדם

תקציר

מקור: Wolsk, H. M. et al., דגימה לא פולשנית של נוזל רירית רירית לכימות רמות מתווך חיסוני בדרכי הנשימה העליונות in vivo.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את כימות רמות המתווך החיסוני בתמצית נוזל רירית האף האנושית בילוד. מערכת בדיקת מולטיפלקס מבוססת אלקטרוכימילומינסנציה מודדת מתווכים אלה על ידי הערכת עוצמת האור הנפלט כאשר הם מעוררים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. מערך ניסיוני

1. השתמש בגיליונות נייר סינון (גיליונות פוליאסטר סיביים הידרוקסילטים, ראה טבלת חומרים).
   1. גזור רצועות בגודל 3 x 15 מ"מ לילד בן חודש ובצורת L לילדים גדולים יותר ומבוגרים (5 x 20 x 10 מ"מ (זרוע קצרה של L)).
2. הכנס פיסת נייר סינון אחת לכל נחיר של תינוק באמצעות מלקחיים. הניחו את נייר הסינון בחלק הקדמי של הטורבינאט התחתון (כ-1 ס"מ בתוך הנחיר ליילודים ו-1.5 ס"מ לכל שאר הגילאים).
   1. הניחו יילודים על מיטה ותנו להם מי סוכר לנוחותכם.
      הערה: עבור ילדים בכל הגילאים האחרים, הדגימה מתבצעת בקלות רבה ביותר כאשר הנבדק יושב על כיסא.
   2. עבור ילדים גדולים יותר, הכנס את הזרוע הארוכה של נייר הסינון בצורת L לכל נחיר.
3. יש למרוח אטב לאף סביב הנחיריים כדי למזער את אי הנוחות ולמנוע אובדן מקרי של נייר הסינון.
4. הסירו את ניירות הסינון לאחר 2 דקות של ספיגה.
5. הניחו את ניירות הסינון בצינורות המסומנים והקפיאו אותם מיד בטמפרטורה של -80°C.
6. רשום את כל הסימפטומים של זיהום בדרכי הנשימה המוצגים על ידי הילד ביום הדגימה.
7. תעד כל התעטשות, בכי מתמשך או אפיסטקסיס המתרחשים במהלך 2 דקות הדגימה.

2. כימות מתווכי מערכת החיסון בדרכי הנשימה

1. קחו עד 10 דגימות אקראיות מהמקפיא. רשום את מספרי הזיהוי. שמור את הדגימות על קרח במהלך כל תהליך העבודה.
2. לאחר ההפשרה על קרח, טבלו את ניירות הסינון (לכל נושא) משני הנחיריים ב-300 מיקרוליטר של חיץ טרי שהוכן (ראו טבלת חומרים) המכיל טבליה אחת שלמה של מעכב פרוטאז (ראו טבלת חומרים) לכל 25 מ"ל חיץ.
   1. התאם את עוצמת הקול של המאגר בהתאם לגודל נייר הסינון.
      1. השתמש במאגר של 300 μL עבור ניירות סינון בגודל 3 x 15 מ"מ.
      2. אם רק נייר סינון אחד זמין, השתמש במחצית מנפח המאגר (150 μL).
3. מעבירים את הדגימות לשייקר צלחות (400 סל"ד) למשך 5 דקות. השתמשו בטיימר.
4. העבירו את ניירות המסנן הלחים ואת חיץ הבדיקה לכוס של מסנן צינור תאית אצטט (גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר) הממוקם בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה (ראו טבלת חומרים).
5. צנטריפוגה במהירות 16,000 x גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת (ב-4°C) לקבלת תמצית אף מסוננת בצינור.
6. הוציאו את הכוס והשאירו את הצינורות על קרח תוך כדי החדרת תמצית האף לבארות של לוחות אחסון דלי חלבון (ראו טבלת חומרים).
7. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
8. קבע את ריכוזי הציטוקינים והכימוקינים בתמציות האף באמצעות מערכת מערך מרובב מבוססת אלקטרוכימילומינסנציה בעלת רגישות גבוהה (ראה טבלת חומרים).
   ג: כאן בוצעו בדיקות ציטוקינים 10-plex T_H1/T_H2, 9-plex chemokine assay, ו-single-plex interleukin-17A (IL-17A), טרנספורמציה של גורם גדילה-beta1 (TGF-β1) ולימפופויאטין סטרומה תימית (TSLP).
   1. עבור הבדיקות, לדגור על תמציות האף לילה ב 4 ° C. בצע את המדידות בהתאם לפרוטוקול היצרן הסטנדרטי (ראה טבלת החומרים).
      הערה: לבדיקות החיסוניות (ראו טבלת החומרים) יש בדרך כלל טווח דינמי גבוה למדידה שנע בין 1 ל-10,000 pg/mL, אך עבור בדיקות מסוימות, הוא יכול להיות 100,000 pg/mL. משמעות הדבר היא כי כל הדגימות ניתן להפעיל באותו דילול, ובכך להגביל את ההשפעה של דילולים שונים בנבדקים בריאים וחולים, כפי שקורה במערכות חיסון דומות אחרות. הגבול התחתון של גילוי כל הציטוקינים היה 1 pg/mL או פחות, ועבור chemokines, הוא נע בין 1 ל 50 pg/mL. TSLP לא היה ניתן לזיהוי ב -98% מהדגימות בגיל חודש אחד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יריעות פוליאסטר סיביות הידרוקסילציה	Accuwik Ultra	SPR0730	נייר סינון
מאגר בדיקה של מיליפלקס	מיליפור	L-AB	מאגר
לוחות אחסון דלי חלבון	תרמו סיינטיפיק	CLS8161	צלחות
מעכב פרוטאז	רוש	11873580001	קוקטייל מעכבי פרוטאז שלם ללא EDTA
קורא של לוחות מרובי כתמים	מזוסקייל	נה	Sector imager 6000
בדיקות	מזוסקייל		בדיקת ציטוקינים 10-plex TH1/TH2 אנושית ובדיקת כימוקין 9-plex, ו-singleplex IL-17A, TGF-β1 ו-TSLP. תיאור ניתן למצוא באינטרנט על www.mesoscale.com