Method Article

בדיקת מחשוף פפטיד פלואורוגני לבדיקת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein acplayation. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות באמצעות פפטידים פלואורוגניים. הפרוטאז מזהה את מיקום המחשוף שלו על הפפטיד, חותך אותו ומפריד את המרווה מהפלואורופור, מה שמאפשר את פליטת הפלואורסצנטיות שלו. האות הפלואורסצנטי מזוהה ומנותח כדי לבדוק את יעילות המחשוף של גרסאות פפטידים שונות.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון והכנת הפפטידים

  1. רכוש את רצף חלבון ההיתוך המעניין ממסד נתונים ציבורי כגון NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) או מסד הנתונים של פתוגן הנגיף (https://www.viprbrc.org). בחר את אתר זיהוי הפרוטאז שקדם לפפטיד ההיתוך וכלול 2-3 חומצות אמינו במעלה ובמורד הזרם של רצף זה.
  2. בעת הזמנת הפפטידים, שנה אותם עם זוג FRET 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) ב- N-terminus ו- N-2,4-dinitrophenyl (DNP) ב- C-terminus.
    הערה: מספר ספקים מספקים שינויים אלה. המחיר וזמן האספקה תלויים בספק הנבחר. עם זאת, קיימים שינויים חלופיים המשתנים ברגישותם ודורשים התאמות של קורא הלוחות מבחינת אורכי הגל.
  3. השהה מחדש את הפפטיד בהתאם ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פפטידיםביומטיקלא ישים
פוריןנבP8077S
טריפסין, מטופל ב-TPCKסיגמא-אולדריץ'4352157-1KT
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375
CaCl2סיגמא-אולדריץ'C1016
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M6250
טריטון-X100סיגמא-אולדריץ'X100
PBSקורנינג21-040-CV
SpectraMax Gemini XPSהתקנים מולקולרייםXPS
SoftMax Pro 6.5.1 התקנים מולקולרייםלא ישים
צלחת 96 באר (פוליסטירן שחור מוצק עם תחתית שטוחה ולא מטופלת)כוכב משנה3915
צינורות שיכוך אורמעבדת ווטסון131-915BL או 131-915BR

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorogenic Peptide Cleavage AssayProtease Proteolytic ActivityFluorophore Quencher SystemFluorescence Plate ReaderProtease Cleavage SiteSpike Protein ActivationPeptide Variant ScreeningProtease Activity MeasurementFluorescence Signal DetectionProteolytic Cleavage Efficiency

Related Articles