בדיקת מחשוף פפטיד פלואורוגני לבדיקת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות

תקציר

מקור: Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein acplayation. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות באמצעות פפטידים פלואורוגניים. הפרוטאז מזהה את מיקום המחשוף שלו על הפפטיד, חותך אותו ומפריד את המרווה מהפלואורופור, מה שמאפשר את פליטת הפלואורסצנטיות שלו. האות הפלואורסצנטי מזוהה ומנותח כדי לבדוק את יעילות המחשוף של גרסאות פפטידים שונות.

פרוטוקול

1. תכנון והכנת הפפטידים

1. רכוש את רצף חלבון ההיתוך המעניין ממסד נתונים ציבורי כגון NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) או מסד הנתונים של פתוגן הנגיף (https://www.viprbrc.org). בחר את אתר זיהוי הפרוטאז שקדם לפפטיד ההיתוך וכלול 2-3 חומצות אמינו במעלה ובמורד הזרם של רצף זה.
2. בעת הזמנת הפפטידים, שנה אותם עם זוג FRET 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) ב- N-terminus ו- N-2,4-dinitrophenyl (DNP) ב- C-terminus.
   הערה: מספר ספקים מספקים שינויים אלה. המחיר וזמן האספקה תלויים בספק הנבחר. עם זאת, קיימים שינויים חלופיים המשתנים ברגישותם ודורשים התאמות של קורא הלוחות מבחינת אורכי הגל.
3. השהה מחדש את הפפטיד בהתאם להמלצות היצרן על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה. לדוגמה, להשעות פפטידים באתנול 70% לריכוז הסופי של 1 mM.
4. לחלופין, הוסף את הצינור המכיל את הפפטיד ואת הממס לתוך אמבט סוניקציה עד שהוא מושעה מחדש לחלוטין אם הפפטיד אינו משהה היטב על ידי פיפטינג.
5. Aliquot את הפפטיד לתוך צינורות מרטיבי אור או עמידים כדי להגן על הפפטיד מפני הלבנה. שמור על גדלי aliquot קטנים כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה מרובים (למשל, 100 μL). אחסן aliquots ב -20° C.

2. הכנת קורא לוחות הפלואורסצנטיות

1. הפעל את קורא הצלחות והמתן עד לסיום הבדיקה העצמית.
2. פתח את תוכנת ההפעלה במחשב המחובר וודא שהיא מחוברת לקורא הלוחות.
3. פתח את הגדרת הטמפרטורה והגדר אותה ל- 30 ° C (או הטמפרטורה הנדרשת לביצועים מיטביים עבור הפרוטאז).
4. לחץ על Control | הגדרת מכשיר להגדרת הניסוי.
5. בחר Kinetic.
6. בחר פלואורסצנטיות.
7. הזן אורכי גל עירור ופליטה: 330 ננומטר ו- 390 ננומטר בהתאמה.
8. בטל את הבחירה באפשרות Auto Cut-off.
9. בחר רגישות בינונית, רגילה.
10. בחר זמן ריצה של שעה אחת עבור הבדיקה ובחר מדידה אחת כל 60 שניות.
11. קבעו ערבוב של 5 שניות לפני המדידה הראשונה ו-3 שניות לפני כל מדידה
12. בחר בארות כדי לקרוא ולהתחיל את הבדיקה.

3. הכנת הבדיקה

1. הכן את מאגר הבדיקה על ידי חישוב הכמויות המתאימות עבור כל מרכיב והוספתו. עבור furin, לעשות חיץ המורכב 100 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, ו 5% Triton X-100. עבור טריפסין, השתמש בתמיסת מלח סטנדרטית חוצצת פוספט (PBS).
   הערה: נפחים של 10 מ"ל או פחות מספיקים. בהתאם לפרוטאז(ים) המשמשים בבדיקה, המאגר משתנה.
2. מצננים את החיץ על קרח.
3. הניחו את צלחת הבדיקה על קרח עם צלחת מתכת דקה מתחתיה לתמיכה בקירור וביציבות. השתמש צלחת פוליסטירן שחור מוצק 96 באר עם תחתית שטוחה ולא מטופל.
   הערה: חיוני להשתמש בלוחות שחורים כדי למנוע "דליפה" פלואורסצנטית מבארות סמוכות.
4. חשב את כמות הפרוטאז המתאימה להוסיף עבור כל תגובה בהתבסס על פרסומים קודמים או נתוני ניסוי. עבור furin, להשתמש 1 יחידה לכל תגובה אשר מתאים 0.5 μL. עבור טריפסין, השתמש 0.5 μL של 160 ננומטר TPCK טריפסין.
5. לכל דגימה להכין 3 עותקים טכניים משוכפלים לכל בדיקה בנפח כולל של 100 μL לכל דגימה.
   הערה: הוערך בניסוי כי אין זה משנה אם הצנרת מתבצעת בתנאי אור רגילים או באור מעומעם. עם זאת, הפפטידים לא צריכים להיות חשופים לאור במשך תקופה ארוכה של זמן.
6. פיפטה: הכמות המתאימה של מאגר הבדיקה (94.5 μL כמתואר בסעיף 3.1) לכל באר.
7. מוסיפים את הפרוטאז לכל באר. עבור שניהם, furin ו TPCK טריפסין, להשתמש 0.5 μL לכל דגימה. ל-6 בארות (3 בארות לבקרה ריקה ו-3 בארות לבקרה פפטידית), הוסיפו חיץ של 0.5 מיקרוליטר במקום הפרוטאז המתאים.
8. הוסף את הפפטיד לריכוז סופי של 50 מיקרומטר בכל באר למעט הבקרה הריקה. במקרה זה, פיפטה 5 μL פפטיד הוכן כמתואר תחת שלב 1.3. הוסף 5 μL של מאגר לפקד הריק במקום peptide.
   הערה: מספר ריכוזים של הפפטיד נבדקו תחילה עם ריכוזי האנזימים המתוארים כדי להבטיח שהאנזימים היו רוויים.
9. הכנס את הצלחת לקורא לוחות הפלואורסצנטיות ולחץ על התחל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פפטידים	ביומטיק	לא ישים
פורין	נב	P8077S
טריפסין, מטופל ב-TPCK	סיגמא-אולדריץ'	4352157-1KT
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C1016
2-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M6250
טריטון-X100	סיגמא-אולדריץ'	X100
PBS	קורנינג	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	התקנים מולקולריים	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	התקנים מולקולריים	לא ישים
צלחת 96 באר (פוליסטירן שחור מוצק עם תחתית שטוחה ולא מטופלת)	כוכב משנה	3915
צינורות שיכוך אור	מעבדת ווטסון	131-915BL או 131-915BR