ניטור הגעתם של חלבוני שטח מתויגים GFP לרשת טרנס-גולג'י באמצעות ננו-גופים פונקציונליים

תקציר

מקור: Buser, D. P., et al. אנליזה של ספיגה אנדוציטית והעברה לאחור לרשת טרנס-גולג'י באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים בתרבית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה לחקר קליטה והובלה לאחור של ננו-גופים פונקציונליים כדי להבין את מסלולי התעבורה התוך-תאיים שלהם. על ידי החדרת סולפט רדיואקטיבי ושימוש בטכניקות בידוד וזיהוי, שיטה זו מאפשרת לחקור ספיגה אנדוציטית והגעת רשת טרנס-גולג'י של חלבוני מטען.

פרוטוקול

1. ספיגה של ננו-גופים פונקציונליים על ידי תאים בתרבית (לניתוח סולפציה)

1. בתרבית תאים, זרע ~ 400,000 עד 500,000 תאי HeLa המבטאים ביציבות חלבון כתב מתויג GFP בצלחות 35 מ"מ או על אשכולות 6 בארות עם תווך מלא המכיל אנטיביוטיקה (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco, DMEM, בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), 100 יחידות / מ"ל סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, ו 1.5 מיקרוגרם / מ"ל puromycin).
   הערה: כפי שהוזכר לעיל, אנו משתמשים כאן בתאי HeLa המבטאים ביציבות EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP למטרות המחשה. מלבד קווי תאים יציבים, גם HeLa transiected transiently ניתן להשתמש.
2. לדגור על התאים O/N ב 37 ° C באינקובטור 7.5% CO₂ כדי להתרבות.
   הערה: תאים צריכים להיות מפגש של ~ 80% למחרת.
3. הסר את המדיום המלא, שטוף פעמיים עם 1x PBS ב- RT, והרעיב את התאים עם מדיום ללא סולפט (SFM) למשך שעה אחת ב- 37 ° C באינקובטור 7.5% CO₂.
   הערה: SFM מוכן על ידי הוספת 10 מ"ל של חומצות אמינו MEM (50x) פתרון, 5 מ"ל של L-גלוטמין (200 mM), 5 מ"ל של תמיסת ויטמין (100x), ו 900 μL של CaCl₂·2H₂O עד 500 מ"ל של מלחים מאוזנים של Eagle. עוברים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואליקוט.
4. במכסה מנוע מאוורר או בספסל המיועד לעבודה רדיואקטיבית, הכינו מדיום סימון סולפט המכיל 0.5 mCi/mL [³⁵S] סולפט כמלח נתרן ב-SFM.
   זהירות: טפל בזהירות בכל הפתרונות המכילים רדיואקטיביות. יש לעבוד רק במנדפים או בספסלים ייעודיים. יש לאסוף ולהשליך בנפרד את כל החומר (טיפים, צינורות, צלחות וכו') או מאגרי כביסה הבאים במגע עם רדיואקטיביות. בצע פעולה זו גם עבור כל השלבים הבאים (שלבים 1.5-1.18).
5. הוסף VHH-2xTS ב-1x PBS למדיום סימון סולפט לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל
   הערה: כבקרה, כלול גם VHH-std או ננו אחר נטול אתרי TS כדי להדגים תיוג ספציפי.
6. יש להחליף את SFM ב-0.7 מ"ל של מדיום סימון סולפט המכיל 0.5 mCi/mL [35S] סולפט ו-2 מיקרוגרם/מ"ל VHH-2xTS ולדגור על התאים למשך שעה אחת ב-37°C באינקובטור CO₂ של 7.5% המיועד לעבודה עם רדיואקטיביות.
   הערה: בהתאם לניסוי המתוכנן, הזמן של סולפטציה ננו צריך להיות מותאם. בנוסף, כדי לקבוע קינטיקה של הגעת TGN, התיוג מתבצע לזמנים שונים (למשל, במשך 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות וכו ').
7. הסירו את מדיום הסימון ושטפו את התאים 2-3 פעמים עם PBS קר כקרח 1x על צלחת קירור או קרח.
8. הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזיס (PBS המכיל 1% Triton X-100 ו 0.5% deoxycholate) בתוספת 2 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x ודגור את התאים במשך 10-15 דקות על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C.
9. מגרדים ומעבירים את הליזט לצינור בנפח 1.5 מ"ל, מערבלים את הליזט ומניחים למשך 10-15 דקות על מסובב מקצה לקצה בטמפרטורה של 4°C.
10. הכינו ליזט פוסט-גרעיני באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
11. באמצעות צינור חדש של 1.5 מ"ל, הכינו 20-30 μL של תרחיף של חרוזי ניקל בצינור של 1.5 מ"ל ושטפו פעם אחת עם 1x PBS על ידי כדוריות עדינות שלהם ב 1,000 x גרם למשך 1 דקות.
    הערה: במקום חרוזי ניקל, ניתן להשתמש בחרוזי סטרפטאבידין (אם הננון הוא ביוטינילציה) או חרוזי חלבון A עם IgG כנגד אפיטופ של הננון (T7- או HA-tag).
12. מעבירים את הליזט הפוסט-גרעיני לתוך צינור של 1.5 מ"ל המכיל חרוזי ניקל ודגרים במשך שעה אחת ב-4°C על מסובב מקצה לקצה כדי לבודד את הננו-גופים. הסר aliquot (50-100 μL) של הליזט הפוסט-גרעיני והרתיח במאגר דגימת SDS לניתוח אימונובלוט עוקב של ננו-גוף הקשור לתא כולל, כתב GFP ובקרת טעינה.
13. שטפו את החרוזים 3 פעמים עם 1x PBS או חיץ ליזיס על ידי כדוריות עדינות במינון של 1,000 x גרם למשך דקה
    הערה: לשטיפה מחמירה יותר של חרוזים, 20 mM imidazole יכול להיכלל PBS או חיץ lysis.
14. הסירו בזהירות את כל חיץ הכביסה מהחרוזים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 2x מאגר דגימה והרתיחו במשך 5 דקות ב-95°C.
15. טען את שני החרוזים המבושלים על ג'ל midi 12.5% SDS-PAGE והפעל לפי פרוטוקול PAGE הסטנדרטי עד שצבע הייחוס (למשל, ברומופנול כחול) הגיע לסוף הג'ל המפריד.
    הערה: ניתוח אימונובלוט של ננו-גוף הכולל הקשור לתאים, כתב GFP ובקרת העמסה יכול להתבצע גם באמצעות מיני 12.5% SDS-PAGE או ג'ל שיפוע precast.
16. תקן את ג'ל ההפרדה ב~ 30 מ"ל של חיץ קיבוע (10% חומצה אצטית ו 45% מתנול ב ddH₂O) במשך 1 שעה ב RT, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים עם ~ 50 מ"ל של מים deionized, ולהתכונן לייבוש ג'ל.
17. ג'ל SDS-PAGE לייבוש.​
    1. מניחים בזהירות את הג'ל הקבוע על סרט נצמד מתוח ומכסים אותו בנייר סינון חתוך מראש.
    2. הניחו את הג'ל עם נייר המסנן על גבי משטח הייבוש, הניחו את מכסה הוואקום והפעילו את משאבת הוואקום לייבוש בג'ל. יבש את הג'ל במשך 3-5 שעות.
    3. הסר את סרט ההיצמדות והכנס את הג'ל המיובש לקלטת אוטורדיוגרפיה המצוידת במסך זרחן.
18. תמונה אוטורדיוגרפית באמצעות Phosphor Screen Imager. בצע את ההוראות של manufacturer.
    הערה: בהתאם לעוצמת האות, ג'לים מיובשים צריכים להיחשף זמן רב יותר עם מסכי זרחן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן נגד GFP	סיגמא-אולדריץ'	1.18145E+11	המוצר מופץ על ידי SigmaAldrich, אך מיוצר על ידי Roche
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	סיגמא-אולדריץ'
סרום עגל עובר (FCS)	ביוווסט
גופרית-35 בצורת נתרן גופרתי	הרטמן אנליטיקס	ARS0105	המוצר מכיל 5 mCi
צלחות 6 בארות	TPP	92406
פרפורמאלדהיד (PFA)	אפליכם	A3813
פלואורומאונט-G	סאות'רן ביוטק	0100-01
ג'ל TGX Mini-Protean, 4-20%, 15- באר	ביו-ראד	456-1096