בדיקה לכימות פגוציטוזה בתיווך נוגדנים של אריתרוציטים נגועים בטפילים

תקציר

מקור: Quintana, M. d. P. et al., מדידת נוגדנים הגורמים לפאגוציטוזיס שנרכשו באופן טבעי לטפילי פלסמודיום פלציפרום על ידי בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה.J. Vis. Exp.(2020)

סרטון זה מדגים בדיקת פאגוציטוזיס מבוססת ציטומטריה של זרימה הכוללת אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום מסומנים ואופסוניים על ידי מונוציטים. ציטומטריית זרימה מזהה פלואורסצנטיות במונוציטים, המאשרת את הזיהוי המוצלח של אריתרוציטים opsonized באמצעות phagocytosis.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. תרבות הטפילים

הערה: פעל בהתאם לתקנות המקומיות לטיפול בפתוגנים אנושיים.

1. לשמור על טפילי פלסמודיום פלציפרום בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי כפי שתואר קודם לכן במדיום תרבית הטפילים (ראה טבלת חומרים).
2. שמור על הטפילים מסונכרנים היטב באמצעות טיפול סורביטול כפי שתואר קודם לכן.
3. כדי להבטיח ביטוי VAR2CSA על פני השטח של אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום (IE), בצע סבבים חוזרים ונשנים של ברירה חיסונית-מגנטית באמצעות נוגדן אנטי-VAR2CSA (למשל, נוגדן PAM1.4, נוגדן חד-שבטי אנושי צולב VAR2CSA ספציפי IgG) המצומד לחרוזים מגנטיים של חלבון G.
   1. בקצרה, לדגור trophozoite-IEs בשלב מאוחר עם חרוזים מגנטיים מחוברים נוגדן אנטי VAR2CSA ולבחור באופן חיובי באמצעות מגנט.
   2. הרחיבו את הטפילים שנבחרו בתרבית למספר מחזורים עד לטפילים בשיעור של 5% לפחות.
   3. לחלופין, בחרו טפילים הנקשרים ל-CSA משותק פלסטיק (הקולטן ל-VAR2CSA) כפי שתואר קודם לכן.
4. כדי לאמת ביטוי VAR2CSA על הטפילים שנבחרו, בצע ציטומטריית זרימה כפי שתואר קודם לכן.
   1. בקצרה, תייגו את הטרופוזואיטים-IEs בשלב מאוחר עם אותו נוגדן המשמש לבחירה המגנטית (שלב 1.3) ואחריו נוגדן משני מסומן פלואורסצנטית.
   2. מדוד את תגובתיות פני השטח של IE לפי ציטומטריית זרימה. בחירת נוגדנים מוצלחת מביאה בדרך כלל לאוכלוסיית טפילים המבטאת VAR2CSA ברוב הטפילים (≈80%).
5. עבור בדיקת phagocytosis, להשתמש מטוהרים באמצע עד שלב מאוחר trophozoite-IEs. בצע טיהור באמצעות הפרדה מגנטית כמתואר לעיל.
   הערה: כדי לקבוע במדויק את שלב הטפילים, לבצע צביעת Giemsa על מריחות דם ואחריו תצפית במיקרוסקופ אור. פעל בהתאם לנהלים סטנדרטיים ולהנחיות מורפולוגיות כפי שתוארו לעיל. טיהור בשלב מאוחר יכול להתבצע גם באמצעות מדיום שיפוע צפיפות. אולם מניסיוננו תפוקת IE נמוכה יותר, ולכן עדיף טיהור מגנטי.
   1. להפרדה מגנטית, סובבו את תרבית הטפיל (5-10% פרזיטמיה) במהירות של 500 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיום תרבית טפיל.
   2. הוסיפו את תרחיף הטפיל לתוך Claricep Flash Silica, עמודת CS המצומדת למגנט (ראו טבלת חומרים) ותנו לו לעבור באיטיות דרך העמודה. Trophozoite-IEs הם paramagnetic (בשל נוכחות hemozoin) ויישאר ברשת עמודה.
   3. לשטוף את העמוד עם 50 מ"ל של מדיום תרבית טפילים ולחקות את IEs מן העמודה המגנטית באמצעות 50 מ"ל של מדיום תרבית טפיל.
6. סובב את הפולט מ- 1.5.3 ב- 500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להשליך את supernatant ו להשעות אותו מחדש ב 1 מ"ל של מדיום תרבית טפיל.
7. באמצעות המוציטומטר, ספור את מספר IEs (מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופ אור כמו אריתרוציטים עם פיגמנט hemozoin כהה) ואת מספר התא הכולל כדי לחשב את הטפילים הסופי (אחוז IEs).
   הערה: השתמש רק טפילים עם לפחות 80% טוהר (80% IEs).
8. בהתבסס על מספר דגימות הסרום/נוגדנים המתוכננות לבדיקה, העריכו את הכמות הכוללת של IEs הדרושים והגדילו את תרביות הטפילים בהתאם. בקבוק תרבית^{בגודל 75} ס"מ עם 25 מ"ל תרבית ב-5% המטוקריט ו-5-10% פרזיטמיה אמור להניב מספיק IEs כדי להפעיל צלחת מלאה של 96 בארות. עבור צלחת מלאה (42 דגימות ועוד 6 פקדים כפולים), יש צורך בהשעיית טפיל מינימלית של 1.5 מ"ל ב- 3.3 x 10⁷ IEs/mL.

2. תאי THP-1

הערה: קו התאים THP-1 משמש בבדיקה זו. קו תאי מונוציטים זה נגזר מחולה עם לוקמיה מונוציטית וניתן לרכוש אותו מאוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC). שמור על קו התאים בהתאם להוראות הספק במדיום תרבית THP-1 (ראה טבלת חומרים).

1. לתחזוקה שוטפת, התחל תרבית תאים THP-1 ב 2-4 x 10⁵ תאים / מ"ל ותת-תרבית כאשר ריכוז התאים מגיע 8 x 10⁵ תאים / mL.
   הערה: אין לאפשר לריכוז התא לעלות על 1 x 10⁶ תאים/מ"ל ולעקוב אחר מספר המעבר. הימנע משימוש בתאים שהם מעבר למעבר 25. זמן ההכפלה הממוצע של קו תאי THP-1 נע בין 19-50 שעות. קבע את זמן ההכפלה של אצוות התא לפני תחילת ניסויי הפאגוציטוזה. זה יעזור להעריך בערך את כמות התרבית הדרושה למספר מוגדר של דגימות סרום להיבדק (למשל, עבור צלחת מלאה 96 באר, 10 מ"ל של תרבית ב 5 x 10⁵ תאים / מ"ל נדרשים).
2. בדוק מעת לעת את תאי THP-1 עבור ביטוי פני השטח של קולטני Fcγ I (CD64), II (CD32) ו- III (CD16) כפי שתואר קודם לכן.
   1. בקצרה, הכתימו את תאי THP-1 (בנפרד) בנוגדנים מסומנים פלואורסצנטית נגד CD64, אנטי-CD32 ואנטי-CD16 (טבלת חומרים) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (דילול 1:100 שהוכן בסרום בקר עוברי 2% (FBS) במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
   2. יש לשטוף שלוש פעמים עם 2% FBS ב-PBS ולמדוד את צביעת פני השטח לפי ציטומטריית זרימה.
      הערה: תאי THP-1 שליליים עבור CD16 וחיוביים עבור CD32 ו-CD64 כפי שדווח בעבר (איור 1).
3. עבור בדיקת phagocytosis, להגדיר בקבוק תרבית תאים THP-1 עם 2.5 x 10⁵ תאים / מ"ל יום לפני הניסוי כדי להניב סביב 5 x 10⁵ תאים / מ"ל ביום הבדיקה.
   הערה: ודא 4-6 x 10⁵ תאים / מ"ל נמצאים ביום הבדיקה.

3. בדיקת פגוציטוזיס (איור 2)

1. לפני תחילת הבדיקה, לחסום (>1 שעות) שתי צלחות באר עגולות למטה 96 (אחד עבור opsonization ואחד עבור phagocytosis) באמצעות 150 μL לכל באר של סטרילי 2% FBS ב PBS.
   הערה: יש לסמן את לוחית 1 כלוחית אופסוניזציה ולהשתמש בה הן לצביעת אתידיום ברומיד (EtBr) והן לאופסוניזציה. יש לסמן את צלחת 2 כצלחת פגוציטוזה ולהשתמש הן לציפוי תאי THP-1 והן לשלב הפאגוציטוזה.
2. צביעת טפיל ואופוניזציה
   1. קח את מתלה IE מוכן ב 1.6 והתאם את ספירת התאים ל 3.3 x 10⁷ IEs/mL על ידי הוספת מדיום תרבית טפיל ואתידיום ברומיד (EtBr) כדי להשיג ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל (דילול 1:40, ממלאי 0.1 מ"ג / מ"ל).
      הערה: EtBr מכתים את הדנ"א של הטפיל, ומאפשר זיהוי על ידי ציטומטריית זרימה.
      זהירות: EtBr הוא מוטגן ומגרה עור, עיניים ונשימה. השתמש בהגנה מתאימה והשלך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
   2. מוציאים את תמיסת החסימה מאחת מ-96 צלחות הבאר (צלחת אופסוניזציה), הופכים את הצלחת ומסירים עודפי נוזלים מעל פיסת נייר מגבת.
   3. מוסיפים 30 μL לכל באר של מתלה IE שהוכן לעיל במחצית העליונה של הצלחת. השאירו באר אחת ריקה והוסיפו 30 μL של מדיום תרבית טפילים (ללא IEs עבור THP-1 בלבד בקרה). (איור 3A). יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור.
   4. הוסף 170 μL לכל באר של מדיום תרבית טפילים. סובבו את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו את supernatant על ידי העברת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
   5. שטפו את IEs המסומנים ב-EtBr פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של מדיום תרבית טפילים, וסובבו את הצלחת במהירות של 500 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את הסופרנאטנט מהשטיפה הראשונה על ידי הזזת הצלחת. מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט מהכביסה השנייה באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לוודא שכל נפח אמצעי הכביסה מוסר. אין להפריע לכדור.
   6. השהה מחדש את IEs המסומנים ב- EtBr ב- 30 μL של נוגדן/פלזמה/תמיסת סרום שהוכנה בריכוזים הרצויים בתווך תרבית טפיל.
   7. כלול תמיד את הפקדים הבאים (איור 3B): בקרה ללא בקרת תאי IEs/THP-1 (מדיום תרבית טפילים); בקרה ללא נוגדן או פלזמה/סרום (בקרה לא אופסונית); בקרה חיובית באמצעות נוגדן אריתרוציטים אנטי-אנושי זמין מסחרית בדילול 1:100 (ראה טבלת חומרים); שתי בקרות פלזמה/סרום שליליות בדילול 1:5 (בריכה נאיבית למלריה ובריכה מזכרים שנחשפו למלריה); ובקרת סרום חיובית בדילול 1:5 (מאגר מנשים שנחשפו למלריה, שהיו בהריון בעבר (רצוי מולטיגרבידה).
      הערה: דילול של 1:100 עבור הבקרה החיובית נראה עובד באופן עקבי על פני קבוצות שונות של נוגדנים שנרכשו (הנתונים לא מוצגים). עם זאת, מומלץ לשלול שינויים בין אצוות על ידי בדיקת מספר דילולים בכל פעם שנעשה שימוש באצווה חדשה של נוגדנים.
   8. יש לדגור במשך 45 דקות בחושך ב-37 מעלות צלזיוס.
3. הכנת תאי THP-1 ופאגוציטוזה
   1. בזמן שה-IEs עוברים אופסוניזציה (3.2.8), התחילו להכין את תאי ה-THP-1.
   2. הסר את תאי THP-1 מבקבוק התרבית, סובב אותם כלפי מטה (500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר), נטרל את הסופרנאטנט, והשהה מחדש את הגלולה בתווך תרבית התאים THP-1.
   3. סובבו שוב (500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר), נטרלו את הסופרנטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תאי THP-1.
   4. קבע את ספירת התאים בתמיסה שהוכנה לעיל והוסף מדיום נוסף כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x 10⁵ תאים / מ"ל.
   5. הסר את תמיסת החסימה מהצלחת הנותרת בת 96 הבארות (צלחת פגוציטוזיס) על ידי הזזת הצלחת והסרת עודפי נוזלים מעל פיסת נייר מגבת.
   6. הוסיפו 100 μL לכל באר של תרחיף תאי THP-1 שהוכן ב-3.3.4 והחזירו אותו לאינקובטור תרביות התאים (איור 3C).
   7. לאחר סיום זמן הדגירה של נוגדן/פלזמה/סרום יש להוסיף 170 μL לכל באר של מדיום תרבית טפילים. סובבו את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו את supernatant על ידי העברת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
   8. שטפו את IEs opsonized פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של מדיום תרבית טפילים, סיבוב הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את הסופרנאטנט מהשטיפה הראשונה על ידי הזזת הצלחת. מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט מהכביסה השנייה, באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לוודא שכל נפח אמצעי הכביסה מוסר. אין להפריע לכדור.
   9. לבסוף, השהה מחדש את IEs opsonized ב 100 μL של מדיום תרבית תאי THP-1 שחומם מראש. העבר 50 μL של השעיה IE opsonized לכל באר בצלחת phagocytosis. מאחר שיש בסך הכל 100 μL של IEs, כל דילול נוגדן/סרום יכול להיות מופעל בכפילויות בלוח הפאגוציטוזה (איור 3D)
      הערה: כמות IEs ותאי THP-1 המשמשים בבדיקה תואמים יחס של 10:1.
   10. יש לדגור במשך 40 דקות בחושך בטמפרטורה של 37°C, 5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
       הערה: אין לאפשר phagocytosis להמשיך במשך יותר מ 40 דקות.
   11. עצור את הפאגוציטוזה על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C (500 x גרם, 5 דקות) והשליך את supernatant על ידי הזזת הצלחת. מוסיפים 150 μL של תמיסת ליסינג אמוניום כלוריד בטמפרטורת החדר (טבלה של חומרים) ומערבבים על ידי פיפטינג, דוגרים בדיוק 3 דקות.
       הערה: שלב זה יהיה lyse את אריתרוציטים כי לא phagocytosed על ידי תאי THP-1.
   12. עצור את הליזיס על ידי הוספת 100 μL של FBS קר כקרח 2% ב- PBS. סובבו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C (500 x גרם למשך 3 דקות) והוציאו את הסופרנאטנט על ידי העברת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
   13. יש לשטוף שלוש פעמים באמצעות 200 μL לבאר של FBS 2% קר כקרח ב-PBS, תוך סיבוב הצלחת בטמפרטורה של 4°C (500 x גרם למשך 3 דקות). לאחר השטיפה הסופית, להשהות מחדש ב 200 μL של 2% FBS קר כקרח ב PBS ומיד, לנתח על ידי cytometry זרימה.
       הערה: פרסומים קודמים השתמשו בקיבוע תאים בפרפורמלדהיד 2% לפני ציטומטריית זרימה³¹, אך התוצאות המוצגות כאן הושגו מיד לאחר השלמת הבדיקה. דחיית איסוף נתוני ציטומטריית זרימה על-ידי אחסון הצלחת בטמפרטורה של 4°C אינה מומלצת, מאחר שאחוז תאי EtBr⁺ THP-1 דועך במהירות (איור 4).

4. רכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה

הערה: ניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה התומך בפורמט לוח 96 בארות ובעל לייזרים/מסננים מתאימים למדידת פלואורסצנטיות EtBr.

1. לצורך רכישה, שער על תאי THP-1 באמצעות תרשים פיזור קדמי ליניארי (FSC) לעומת פיזור צדדי ליניארי (SSC) באמצעות הבארות שבהן לא נוספו IEs (איור 2A) ולרכוש 10,000 אירועים על השער הזה.
2. מדוד עוצמת פלואורסצנטיות עבור EtBr (FL3-Log) בשער THP-1 באמצעות תרשים היסטוגרמה.
3. עבור גידור, השער הראשון על תאי THP-1 בחלקת צפיפות FSC לעומת SSC, באמצעות הבארות שבהן לא נוספו IEs (איור 5A). לאחר מכן הגדירו שער חיובי בהיסטוגרמה של FL3 (EtBr), תוך שימוש בתאי THP-1 (לא נוספו IEs) ובבקרה הלא-אופסונית (איור 5B).
4. העתק שערים אלה בכל הדגימות האחרות שנבדקו באותה צלחת וקבע את אחוז תאי THP-1 חיוביים ל- EtBr (תאי THP-1 שיש להם פאגוציטים לפחות IE אחד). עבור כל אחת מהדגימות שנבדקו, ניתן לדווח על פגוציטוזה כערכים מוחלטים (אחוז תאי EtBr⁺ THP-1) או כפאגוציטוזה יחסית המחושבת כאחוז באמצעות הבקרה החיובית כמקסימום.

תוצאות

איור 1: קולטני Fc המתבטאים על פני התא THP-1. (A) קולטן Fcγ III/CD16 (אדום). (B) קולטן Fcγ II/CD32 (ירוק). C. קולטן Fcγ I/CD64 (כתום). תאים ללא תווית מוצגים בכחול.

איור 2: תרשים זרימה של בדיקת פגוציטוזיס.תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים של הבדיקה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96 צלחות תרבית תאים, תחתית עגולה עם מכסה	קורנינג	3799	ניתן להשתמש בכל פלטה דומה, וודאו שהיא תואמת למכשיר ציטומטר הזרימה בו אתם מתכוונים להשתמש
AlbuMAX-II	גיבקו	11021-037
AlbuMAX-II (5%)	-	-	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2 גרם/ליטר היפוקסנטין (Sigma, H9377) ב-RPMI1640 (Sigma, R5886)
נוגדנים נגד תאי דם אדומים	אבקאם	ab34858	הכינו aliquots והקפיאו טמפרטורה של -20°C. השתמשו ב-aliquot אחד לכל ניסוי.
DPBS	סיגמא	P8622
חלבון Dynabeads G	Invitrogen	10003ד
תמיסת אתידיום ברומיד	סיגמא	E1510	הכינו תמיסת מלאי במינון 0.1mg/mL ב-RPMI1640 (R5886). החנות מוגנת מפני אור
ציטומטר זרימה FC500	בקמן קולטר		ניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה התומך בפורמט לוח באר 96 ובעל לייזרים/מסננים מתאימים למדידת פלואורסצנטיות EtBr.
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו	10099-141	יש לחמם ללא הפעלה לפני השימוש.
עכבר FITC CD16 אנטי אנושי	BD Biosciences	555406 או 556618
עכבר FITC CD32 אנטי אנושי	BD Biosciences	552883
עכבר FITC CD64 אנטי אנושי	BD Biosciences	555527
תוכנת FlowLogic	טכנולוגיות Inivai		ניתן להשתמש בכל ניתוח ציטומטריית זרימה, לדוגמה FlowJo או Winlist
גנטמיצין (10 מ"ג/מ"ל)	סיגמא	G1272
היפוקסנטין	סיגמא	H9377
ל-גלוטמין (200mM)	סיגמא	G7513
פתרון ליסינג	-	-	15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS, CS-column ואביזרים	Miltenyi ביוטק	130-041-305
מדיום תרבית טפילים	-	-	2mM L-גלוטמין (Sigma, G7513), 50μg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) ב-RPMI1640 (Sigma, R5886)
פניצילין/סטרפטומיצין (10000U ו-10 מ"ג/מ"ל)	סיגמא	P0781
RPMI-1640 בינוני	סיגמא	₪1496
מדיום תרבות THP-1	-	-	10% FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-גלוטמין (Sigma, G7513), 100U/מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 0.1mg/mL (Sigma, P0781) ב-RPMI1640 (Sigma, R5886)
מגנט Vario MACS	Miltenyi ביוטק