הערה: הפרוטוקולים הבאים מתארים את הכנת הדגימה ואת הכימות של פעילות פרוטאזות סרין נויטרופילים (NSPs). ההליכים הניסיוניים המוצגים כאן מתמקדים בכיח אנושי ואלסטאז נויטרופילים (NE) או במדידת פעילות קתפסין G (CG). עם זאת, התאמות קלות בפרוטוקול הכנת הדגימה מאפשרות ניתוח של תאים שמקורם בדם והומוגנטים סרטניים. בנוסף, ניתן לחקור באופן דומה את פעילויות המטריקס מטאלופרוטאינאז וצתפסין S באמצעות בדיקות FRET ייעודיות
1. הכנת הדגימה: בידוד תאים והפרדת סופרנטנט
הערה: במידת האפשר, הטיפול בכיח צריך להתבצע תוך 120 דקות לאחר הכיוח ויש לאחסן את הכיח על קרח עד לעיבוד נוסף.
- אם כיוח ספונטני של כיח אינו אפשרי, לגרום כיח כפי שתואר קודם לכן. בקצרה, לשאוף 200 מיקרוגרם של β-2-קולטן-אנטגוניסט salbutamol לפני תחילת הליך אינדוקציה כיח. לאחר מכן, שאפו תמיסת מלח היפרטונית (6%) למשך 15 דקות באמצעות נבולייזר. לאסוף את כיח expectorated בצלחת פטרי.
- מפרידים את גושי הריר מהרוק לצלחת פטרי בעזרת קצה פיפטה.
- לשקול את הריר.
הערה: המשקל הממוצע של דגימת ריר הוא 0.8 גרם (משתנה בין 0.1 גרם ל -5 גרם); 0.1 גרם הוא בדרך כלל מספיק כדי לבצע את ההליכים שהוזכרו.
- הוסף 4 חלקים (v/w) של 10% Sputolysin (ב- PBS) לכיח (לדוגמה, 4 מ"ל של 10% Sputolysin עבור כל גרם של כיח).
זהירות: Sputolysin מורכב dithiothreitol מרוכז בחיץ פוספט, ולכן לטפל בו בזהירות.
- דגרו על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר נדנדה במשך 15 דקות כדי להמיס את הריר. מטעמי בטיחות, הכניסו את השייקר למכסה אדים.
- להרוות את התגובה על ידי הוספת אותו נפח של PBS קר (לדוגמה: 1 מ"ל של PBS קר עבור כל מ"ל של 10% Sputolysin).
- מערבבים על ידי pipetting כדי לקבל פתרון הומוגני.
- מסננים את התערובת דרך מסננת תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
- חזור על שלב הסינון דרך מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרומטר.
- צנטריפוגה התמיסה במשך 10 דקות ב 300 x גרם ב 4 ° C.
- מעבירים את החלק הסופרנאטנטי בזהירות לתוך צינור טרי ומאחסנים אותו על קרח.
הערה: ניתן לאחסן את שברי הסופרנאטנט ב -20 ° C או -80 ° C עד ניתוח נוסף.
- השהה מחדש בעדינות את גלולת התא ב 500 מיקרוליטר של PBS קר והניחו אותו על קרח.
הערה: יש לעבד את מקטע התא באופן מיידי.
2. מדידת פעילות פרוטאז נויטרופיל סרין
הערה: כאן מוצגות שיטות שונות לכימות פעילות NSP באמצעות כתבי FET. בחירת הטכנולוגיה מוכתבת על ידי השאלה הביו-רפואית הספציפית ומטרת הניסוי. הבדיקות שהוצגו נבדקו בהרחבה על הספציפיות שלהן מול קבוצה של אנזימים רלוונטיים לריאות. למרות שהגשושיות ספציפיות לכיוון אנזים המטרה שלהן, תמיד לבדוק את ספציפיות הבדיקה על המדגם הקליני של עניין. ניתן להשיג זאת על ידי דגירה של הדגימה עם מעכב פרוטאז ספציפי לפני הוספת הבדיקה, אשר אמור לבטל כל עלייה ביחס התורם/מקבל (D/A).
- כימות פעילות מסיס של NSP באמצעות פלואורימטר או קורא לוחות assay
הערה: ניתן לזהות פעילות פרוטאז בשברים מסיסים של הדגימה באמצעות כל מכשיר המסוגל לזיהוי פלואורסצנטי.
- הפשירו אנזימים על קרח.
- עד לשימוש, יש לשמור את NE ו-CG במאגר אחסון חומצי (50 מ"מ נתרן אצטט, 200 מ"מ NaCl, pH 5.5) למניעת מחשוף עצמי.
- כדי להגדיר עקומה סטנדרטית של אנזים, הכינו דילול סדרתי של האנזים ביחס של 1:2 (33.9 - 0.271 ננומטר עבור NE; 42.6 - 0.333 ננומטר עבור CG) במאגר הפעלה (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl ב- pH 7.5). מאגר ההפעלה הוא בעל pH נייטרלי ולכן מאפשר לקטליזה אנזימטית להתרחש ביעילות.
- כדי להכין את ריכוז התקן הגבוה ביותר (ריכוז NE: 33.9 nM), לדלל 1 μL של NE (33.9 μM) ב 999 μL של מאגר ההפעלה.
- כדי להכין את התקן השני (ריכוז NE: 16.95 ננומטר), מערבבים 200 μL של הדילול הראשון עם 200 μL של מאגר ההפעלה.
- המשיכו בהתאם להכין את הדילולים הנותרים ביחס של 1:2.
- התקן האחרון, שהוא הריק, מורכב ממאגר הפעלה טהור. מומלץ למדוד כפילויות טכניות או טריפליקטים. במהלך הכנת התקן והדגימה, נסו לשמור בקבוקונים על קרח.
- במקביל להכנה הסטנדרטית, לדלל דגימות כיח במאגר הפעלה. דללו את הדגימות האנושיות לפני הערכת פעילות הפרוטאז שלהן כדי להישאר בטווח הליניארי של עלייה באות המדווח (יחס D/A). אם דגימות המטופל היו נותרות לא מדוללות, המחשוף היה קורה מהר מדי עבור התאמה אמינה. מכיוון שכיח תורם בריא מכיל פחות פרוטאזות פעילות בהשוואה לדגימות מחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מבוצעים בדרך כלל דילולים שונים (1:10 עבור סופרנטנט כיח בריא, 1:20-500 עבור סופרנאטנט כיח של חולי COPD או CF).
הערה: על מנת למדוד כמותית את פעילות הפרוטאז בדגימות שבהן ריכוזן אינו ידוע, יש למדוד עקומה סטנדרטית עם ריכוזי אנזימים ידועים במקביל, באופן אידיאלי על אותה צלחת. ריכוז האנזים הפעיל בכיח אנושי מחושב באמצעות אינטרפולציה של המדרונות הנמדדים בדגימות כיח אנושי עם אלה שנמדדו עם העקומות הסטנדרטיות.
- לפני הכנת הדגימות למדידה, הגדר את המכשיר. הגדר את אורך גל העירור עבור הגשושית NE Förster מבוססת העברת אנרגיית תהודה (FRET) (NEmo-1) ל- 354 ננומטר, והגדר את אורך גל הגילוי ל- 400 ננומטר עבור התורם ו- 490 ננומטר עבור המקבל. הגדר את אורך גל העירור עבור בדיקת CG FRET (SSAM) ל- 405 ננומטר, והגדר את הפליטה ל- 485 (תורם) ו- 580 ננומטר (מקבל).
- הוסף 40 μL של דגימות, סטנדרטיות או ריקות לתוך הבארות של צלחת שחורה 96 באר חצי שטח.
- כדי להכין את תערובת האב המכילה את הכתבים (ריכוז הכתב בתמהיל הראשי: 10 מיקרומטר), דללו את מלאי הגשושית (1 מילימטר בדימתיל-סולפוקסיד, DMSO) 1:100 במאגר ההפעלה. הכן את נפח תערובת האב הדרוש על ידי הכפלת 10 μL x מספר בארות הצלחת הנדרשות. כדי להגיע לריכוז הסופי האופטימלי (2 מיקרומטר) למדידת פלואורסצנטיות של כתבי NEmo-1 ו-sSAM, הוסף 10 μL של תערובת האב לכל באר (המכילה 40 μL של דגימה, סטנדרטית או ריקה) והתחל את הקריאה. כתבי NEmo-1 ו-sSAM יעקבו אפוא אחר פעילות אלסטאז נויטרופילים מסיסים וקתפסין G, בהתאמה.
הערה: אם מזרק מגיב אינו זמין, הקפד להתחיל את הקריאה בהקדם האפשרי לאחר הוספת הכתב לדגימות.
- התחל את מדידת קורא הלוחות והקלט את הגדלת יחס D/A כל 60-90 שניות למשך 20 דקות לפחות או עד שהעלייה באות מגיעה לרמה.
- לאחר ייצוא הנתונים, חשב את יחס D/A על ידי חלוקת יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות של התורם (RFU) עם RFU המקבל עבור כל נקודת זמן ודגימה.
- חשב את ממוצע יחס D/A וסטיית התקן של כל דגימה.
- קבע את השיפוע בתוך הצמיחה הליניארית של שינוי יחס D/A. השיפוע הוא אינדיקטור לקצב פיצול האנזים עבור בדיקת FET. חשב את ריכוז האנזים הפעיל בכיח על ידי התאמת שיפועי הרגרסיה הליניארית הנגזרים מהדגימות האנושיות לאלה המחושבים מתקן האנזים.
