$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי.
- הכנת בדיקת נדידת תאים מיקרופלואידית
- הכן תמיסת פיברונקטין של 50 מיקרוגרם/מ"ל על ידי דילול 50 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין מלאי (1 מ"ג/מ"ל) ל-950 מיקרוליטר מלח חוצץ פוספט (DPBS) של דולבקו בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- הכן את מדיום הנדידה על ידי ערבוב 9 מ"ל של מדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) ו- 1 מ"ל של RPMI-1640 עם אלבומין בסרום בקר 4% (BSA).
- הסר את המים שעברו דה-יוניזציה מהמכשיר.
- הוסף תמיסת פיברונקטין 100 μL למכשיר מהשקע. המתן 3 דקות כדי לוודא שכל התעלות מלאות בתמיסת פיברונקטין (fibronectin). הניחו את המכשיר המיקרופלואידי בצלחת פטרי מכוסה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הסר את תמיסת הפיברונקטין מהמכשיר. הוסף אמצעי העברה של 100 μL מהשקע. המתן 3 דקות כדי לוודא שכל הערוצים מלאים באמצעי העברה.
- לדגור על המכשיר עוד שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר מכן המכשיר מוכן לניסוי כימוטקסיס.
- הכנת תמיסה כימואטרקנטית לניסוי כימוטקסיס.
- הכן תמיסת fMLP של 100 ננומטר באמצעי העברה כולל של 1 מ"ל. יש לערבב 5 μL של מלאי FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) עם תמיסת fMLP בצינור 1.5 מ"ל.
הערה: FITC-Dextran משמש למדידת מעבר צבע. לחלופין, השתמש ברודמין כמחוון מעבר הצבע. הפתרון הכימואטרקנטי fMLP מוכן לניסוי הכימוטקסיס.
- הכנת דגימת כיח.
הערה: כימוטקסיס נויטרופילים המושרה על ידי שיפוע של דגימות כיח מחולי COPD נבדק כיישום אבחוני קליני של שיטת All-on-Chip זו.
- השג פרוטוקול אתיקה אנושי לאיסוף דגימות כיח מחולי COPD.
הערה: השגנו אישורים לאיסוף דגימות בבית החולים הכללי Seven Oaks בוויניפג (שאושר על ידי אוניברסיטת מניטובה).
- קבל את טופסי ההסכמה מדעת בכתב מכל הנושאים.
- אסוף דגימות כיח ספונטניות של חולי COPD. מניחים דגימת כיח של 500 μL בצינור של 1.5 מ"ל.
- הוסף 500 μL 0.1% dithiothreitol בצינור 1.5 מ"ל וערבב בעדינות. מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 ° C למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה את הדגימה ב 753 x גרם במשך 10 דקות ולאחר מכן לאסוף את supernatant. צנטריפוגו את הסופרנאטנט ב 865 x גרם במשך 5 דקות ולאחר מכן לאסוף את הסופר הסופי. יש לאחסן את הסופרנאטנט שנאסף במקפיא בטמפרטורה של -80°C לפני השימוש.
- כאשר מוכנים לניסוי הכימוטקסיס, הפשירו את תמיסת הכיח; העבירו מדיום נדידה של 900 מיקרוליטר לצינור של 1.5 מ"ל וערבבו עם תמיסת כיח של 100 מיקרוליטר בתוך ארון בטיחות ביולוגית; לאחר מכן תמיסת הכיח מוכנה לניסוי הכימוטקסיס.
- איסוף דגימות דם.
- השג פרוטוקול אתיקה אנושי לאיסוף דגימות דם מתורמים בריאים. קבל את טופסי ההסכמה מדעת בכתב מכל תורמי הדם.
הערה: כאן התקבלו דגימות בבית החולים הכללי ויקטוריה בוויניפג (שאושר על ידי המועצה לאתיקה מחקרית משותפת באוניברסיטת מניטובה).
- לאסוף את דגימת הדם על ידי venipuncture ולשים את הדגימה לתוך צינור מצופה EDTA. שמור את הצינור בארון בטיחות ביולוגית לפני הניסוי.
2. פעולת בדיקת כימוטקסיס All-on-chip
- בידוד תאים על-שבב (איור 1B).
- יש להניח 10 μL דם שלם בצינור של 1.5 מ"ל בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
הערה: פירוט איסוף דגימות הדם מופיע בסעיף 1.4.
- הוסף קוקטייל נוגדנים 2 μL (Ab) וחלקיקים מגנטיים 2 μL (MP) מערכת בידוד נויטרופילים (ראה טבלת חומרים) לתוך צינור 1.5 מ"ל וערבב בעדינות; זה יסמן תאים בדם למעט נויטרופילים.
- לדגור על תערובת הדם-Ab-MP במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: פעולה זו תתייג באופן מגנטי את התאים המסומנים בנוגדנים בדם.
- חבר שני דיסקים מגנטיים קטנים לשני הצדדים של יציאת טעינת התא של המכשיר. שאפו את המדיום מכל יציאות המכשיר.
- לאט פיפטה 2 μL דם Ab-MP תערובת לתוך המכשיר microfluidic מן היציאה טעינת התא.
הערה: התאים המסומנים בתווית מגנטית נלכדים בדפנות הצדדיות של יציאת טעינת התא בעוד נויטרופילים יזרמו לתוך המכשיר ויילכדו במבנה העגינה של התא.
- המתן מספר דקות עד שמספיק נויטרופילים יילכדו באזור העגינה של התא.
3. בדיקת כימוטקסיס (איור 1C).
- הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על במת המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה בטמפרטורה של 37°C.
- הוסף תמיסה כימואטרקנטית של 100 μL (fMLP או תמיסת כיח) ומדיום נדידה של 100 μL למאגרי הכניסה הייעודיים שלהם באמצעות שני פיפטורים; זה ייצור שיפוע chemoattractant בערוץ השיפוע על ידי ערבוב כימי רציף מבוסס זרימה למינרית בסיוע מבנה איזון לחץ.
הערה: פרטים על איסוף כיח מחולי COPD נמצאים בסעיף 1.3.
- עבור ניסוי הבקרה הבינונית, הוסף רק אמצעי נדידה לשני מאגרי הכניסה.
- רכוש את התמונה הפלואורסצנטית של FITC-Dextran בערוץ מעבר הצבע.
- ייבא את התמונה לתוכנת ImageJ באמצעות הפקודה "קובץ|פתוח".
- מדוד את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות על פני ערוץ מעבר הצבע באמצעות הפקודה "נתח|פרופיל העלילה".
- יצא את נתוני המדידה לגיליון אלקטרוני לצורך התוויית פרטים נוספים.
- יש לדגור על המכשיר בשלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה או באינקובטור קונבנציונלי של תרביות תאים למשך 15 דקות.
- צייר את ערוץ מעבר הצבע באמצעות מטרה של 10X כדי להקליט את המיקומים הסופיים של התאים לצורך ניתוח נתונים.
- במידת הצורך, רשום את נדידת התאים במכשיר באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר.
4. ניתוח נתוני נדידת תאים (איור 1C)
- נתח את בדיקת הכימוטקסיס על ידי חישוב מרחק נדידת התאים ממבנה העגינה כמתואר להלן. ראו איור 1C.
- ייבא את התמונה לתוכנת NIH ImageJ (גרסה 1.45).
- בחרו במרכז כל תא שעבר לערוץ מעבר הצבע.
- מדוד את הקואורדינטות של התאים שנבחרו עבור מיקומם הסופי. מדוד את הקואורדינטות של נקודה בקצה מבנה העגינה כמיקום הייחוס הראשוני.
- יצא את נתוני הקואורדינטות הנמדדים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים (לדוגמה, Excel). חשב את מרחק הנדידה של התאים כהפרש בין המיקום הסופי של התא לבין מיקום הייחוס הראשוני לאורך כיוון מעבר הצבע.
- כיילו את המרחק למיקרומטר. חישוב הממוצע והסטייה של מרחק הנדידה של כל התאים כמדד לכימוטקסיס.
- השווה את מרחק הנדידה בנוכחות שיפוע chemoattractant לניסוי הבקרה הבינונית באמצעות מבחן t של התלמיד.
- אם התמונות בהילוך מהיר של נדידת התאים נרשמות, ניתן לנתח את נדידת התאים ואת הכימוטקסיס עוד יותר על ידי ניתוח מעקב אחר תאים.
הערה: החומרים הדרושים לבנייה ולביצוע בדיקת כימוטקסיס All-on-Chip מפורטים בטבלת החומרים.
