1. הכנת תאי מטרה המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום בגרעין שלהם
- השג קו תאי סרטן עכבר מטרה ממקור מתאים.
הערה: בפרוטוקול זה, נגזרת גרורתית מאוד של תאי גידול חלב עכבר E0771 (E0771-LG) משמש. תאי E0771 הוריים מקורם בעכברי C57BL/6.
- הפשירו ותחזקו בקבוקון של תאי E0771-LG עם מדיום הנשרים המתוקנים (DMEM) של Dulbecco, כולל 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור תרביות תאים בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
הערה: זה צריך להיות מאושר כי תאים שליליים עבור mycoplasma. לשם כך, תרבית תאי E0771 (או תאים שייבדקו) למשך 2-3 ימים כמתואר לעיל (בהיעדר אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה ), ותאסוף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית. צנטריפוגה את התווך ב 12,419 x גרם במשך 60 שניות כדי לסלק פסולת תאים ולהעביר את supernatant לתוך צינורות חדשים. קבע זיהום מיקופלסמה באמצעות ערכת בדיקת מיקופלסמה זמינה מסחרית (עיין בטבלה של חומרים) ו/או PCR בהתאם להוראות היצרן.
- זרעו 5 x 103 תאי E0771-LG לכל באר לתוך צלחת של 12 בארות, ותרביתו את התאים עם 10% (v/v) FBS-DMEM למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
הערה: אם קצב ההתרבות של תאי המטרה נמוך (זמן הכפלת האוכלוסייה גדול מ -36 שעות), ניתן להגדיל את מספר התאים ל 1 x 104.
- החלף את המדיום ב- 1 מ"ל של 10% (v/v) FBS-DMEM כולל פוליברן 10 מיקרוגרם/מ"ל והוסף 25 μL של חלקיקים לנטי-ויראליים (1 x 106 TU/mL) המקודדים חלבון פלואורסצנטי אדום מוגבל גרעינית (mKate2, עיין בטבלת החומרים).
- תרבית את התאים במשך 24 שעות באינקובטור ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
- החלף את המדיום עם 10% (v/v) FBS-DMEM ותגדל את התאים במשך 24-48 שעות באינקובטור ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
- החלף את המדיום עם 10% (v/v) FBS-DMEM כולל 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin כאשר תאים מתחילים לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום, ותרבית את התאים עד שהם 80-90% confluent.
הערה: ריכוז הפורומיצין יהיה שונה בין סוגי תאי היעד ויש לייעל אותו באמצעות תאים לא נגועים.
- תרבית משנה של התאים ששרדו עבור 1-3 מעברים עם 10% (v/v) FBS-DMEM כולל 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, ומלאי cryopreserve במערכת אחסון שלב אדי חנקן נוזלי עד לשימוש.
2. בידוד תאים מדכאים מהגידולים בעכברים
הערה: בפרוטוקול זה, תאים מדכאים (כלומר, מקרופאגים הקשורים לגרורות (MAMs) ותאי מדכא מונוציטים-מיאלואידים (M-MDSCs)) מבודדים מהריאה המכילה גידולים גרורתיים שהוקמו על ידי תאי E0771-LG. התנאים לדיסוציאציה של רקמות ומיון תאים צריכים להיות אופטימליים כדי לבודד את התאים מרקמות שונות.
- הזריקו 1 x 106 תאים סרטניים (E0771-LG) לווריד הזנב של עכברים סינגניים (C57BL/6), נקבה, בני 7-10 שבועות.
- לאחר 14 יום, בודדו את הריאה המכילה גידולים גרורתיים והכינו תרחיפים חד-תאיים מהריאות המחוררות באמצעות עיכול אנזימטי כמתואר קודם לכן.
הערה: בפרוטוקול זה, ארבעה עכברים מוזרקים עם תאים סרטניים והריאות הגרורתיות שלהם משולבות כדי לקבל מספיק תאים מדכאים.
- דגרו על מתלי התא הבודד עם נוגדן CD16/CD32 נגד עכבר למשך 30 דקות על קרח, ומוכתמים בנוגדנים פלואורסצנטיים ל- CD45, F4/80, CD11b, Ly6C ו- Ly6G (עיין בטבלת החומרים) למשך 30 דקות נוספות.
- שטפו את התאים המוכתמים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS המכיל 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA), והשהו מחדש את גלולת התא עם 500-1000 μL של PBS המכיל 2% (w/v) BSA.
- הוסף 3 מיקרומטר של DAPI, ומיין M-MDSCs (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bגבוהLy6Cגבוה) ו- MAMs (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bגבוהLy6Cנמוך) באמצעות סדרן תאים (איור 1).
הערה: הסף של רמת Ly6C להבחנה בין MAMs (Ly6Clow) ו- M-MDSCs (Ly6Chigh) מבוסס על זה של מקרופאגים מכתשית תושבים (RMAC). טוהר התאים הממוינים נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה עם טוהר צפוי של יותר מ-90%.
- השהה מחדש את התאים הממוינים עם 400 μL של DMEM המכיל 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 1% (v/v) חומצת אמינו לא חיונית, 1 mM נתרן פירובט, ו-50 ננומטר 2-מרקפטואתנול (נקרא ENRICHED-DMEM, E-DMEM).
- ספור את מספר התאים החיים באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של Trypan והתאם ל- 2 x 106 תאים/מ"ל עם E-DMEM.
- שמור את התאים על קרח עד לשימוש.
3. בידוד תאי CD8+ T מטחול עכברים
- בודד את הטחול מעכבר סינגני לקו תאי המטרה הסרטניים (כלומר, עכברי C57BL/6 בפרוטוקול זה) באופן הבא:
- הרדימו את בעל החיים על ידי שאיפתCO2.
- הניחו את בעל החיים על קרש דיסקציה נקי ונגבו את העור באתנול 70% (v/v).
- חותכים את עור הבטן באמצעות מספריים כדי לחשוף את הטחול
- בודד את הטחול, אשר ממוקם נחות הבטן, ומניחים אותו לתוך צינור המכיל 5 מ"ל של PBS קר כקרח.
- באמצעות הבוכנה הפנימית של מזרק סטרילי 5 מ"ל, לטחון את הטחול על מסננת תאים 100 מיקרומטר להגדיר על צינור 50 מ"ל.
- העבר את התאים דרך המסנן באמצעות סך של 10 מ"ל של PBS.
- צנטריפוגו את מתלה התא ב 337 x גרם במשך 5 דקות, ושאפו את supernatant.
- יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל PBS המכיל 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ו-0.5% (w/v) BSA (חוצץ ריצה) ולסנן דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
- ספור את מספר התא החי והתאם ל- 1 x 108 תאים/מ"ל באמצעות המאגר הפועל.
הערה: שמור aliquot קטן של תאים כדגימת טרום העשרה לבדיקת טוהר.
- העשר עבור תאי CD8+ T באמצעות ערכת ברירה שלילית וממיין מגנטי (עיין בטבלת חומרים).
- העבר 1 x 108 (1 מ"ל) של תאי הטחול לצינור פוליסטירן עגול תחתון 5 מ"ל.
- מוסיפים 50 μL של נוגדנים ביוטינילטים, ודגורים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- מוסיפים 125 μL של חרוזים מגנטיים מצומדים סטרפטווידין, ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- מוסיפים 1.325 מ"ל של חיץ ריצה, ומערבבים בעדינות על ידי פיפט.
- הכניסו את הצינור למגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות.
- הרימו את המגנט ושפכו את תרחיף התאים המועשר לתוך צינור חדש.
- להשהות מחדש את התאים המועשרים עם 200 μL של E-DMEM (כלומר, DMEM המכיל 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 1% (v/v) חומצת אמינו לא חיונית, 1 mM נתרן פירובט, ו 50 ננומטר 2-mercaptoethanol).
- ספור את מספר התאים החיים והתאם ל- 2 x 106 תאים/מ"ל עם E-DMEM. שמור את התאים ב 37 ° C באינקובטור CO2 עד לשימוש.
הערה: שמור aliquot קטן של תאים כדגימה לאחר העשרה לבדיקת טוהר.
- קבע את הטוהר של תאי CD8+ T על ידי ציטומטריית זרימה כדלקמן:
- קח 1 x 104 תאים מדגימות טרום העשרה (שלב 3.6) או לאחר העשרה (שלב 3.9) והתאם את הנפח הכולל של כל אחת מהן ל- 100 μL באמצעות מאגר פועל.
- יש לדגור על מתלי התא הבודד עם נוגדן CD16/CD32 נגד עכבר למשך 30 דקות על קרח, ולהכתים בנוגדנים פלואורסצנטיים ל-CD45, CD3, CD4 ו-CD8 (עיין בטבלת החומרים) למשך 30 דקות נוספות.
- שטפו את התאים המוכתמים עם 500 μL של PBS המכיל 2% (w/v) BSA, והשהו מחדש את גלולת התא עם 500-1000 μL של PBS המכיל 2% (w/v) BSA.
- הוסף 3 מיקרומטר של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), וקבע את אחוז תאי CD3 + CD4 - CD8 באוכלוסיית תאי CD45+ הכוללת.
4. הפעלה והרחבה של תאי T CD8+ מבודדים
- Aliquot 1 x 105 תאים לכל 50 μL CD8+ תאי T (מוכן בשלב 3.9) לתוך בארות של צלחת U תחתית 96 בארות.
- הוסף 1 x 105 תאים לכל 50 μL תאים מדכאים (מוכן בשלב 2.7) או 50 μL של E-DMEM לתוך הבארות.
- הכן אמצעי הפעלה המורכב מ- E-DMEM, 4 x 104 U/mL גורם מגרה מושבה 1 (CSF-1), 240 U/mL אינטרלוקין-2 (IL-2), 8 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן CD3ε נגד עכבר, ו 16 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן CD28 נגד עכבר.
הערה: CSF-1 אינו נדרש להפעלת תאי T, אך הוא חיוני להישרדותם של תאים מדכאים בפרוטוקול זה (כלומר, MAMs ו- M-MDSCs). לפיכך, הוא נשמר בתרבית משותפת של תאי T עם תאי סרטן המטרה כדי לשמור על עקביות בתנאי התרבית. מאחר ש-CSF-1 נמצא בריכוזים ננו-מולאריים בכל הרקמות, והוא נדרש לקיום מונוציטים/מקרופאגים in vivo, זהו הקשר פיזיולוגי עבור תאים אלה.
- הוסף 50 μL של אמצעי הפעלה (שלב 4.3) ו- 50 μL של E-DMEM עם או בלי ריאגנטים לבדיקה.
- הכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5%CO2, ותרבו את התאים במשך 4 ימים.
5. הגדרת תרבית משותפת של תאי מטרה עם תאי CD8+ T שהופעלו מראש
- הוסף 30 μL של מטריצת קרום מרתף מסיסה מופחתת גורם גדילה מדולל 1:100 (טבלה של חומרים) לבארות של צלחת 96 בארות תחתונה שטוחה המתאימה למיקרוסקופיה, ודגר ב 37 ° C באינקובטור CO2 למשך שעה אחת לפחות.
- הכינו תאי מטרה (כלומר, תאי E0771-LG המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום מוגבל גרעינית).
- דגרו על תאי המטרה עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, וקצרו את התאים על ידי פיפטינג עדין.
- הוסף 9 מ"ל DMEM כולל FBS של 10% (v/v), וצנטריפוגה את מתלה התא ב 337 x g למשך 5 דקות.
- להשעות מחדש את התאים עם 500 μL של E-DMEM, ולספור את מספר התאים החיים.
הערה: לפני ספירת תאי היעד, סנן את התאים דרך מסננת תאים של 40μm כדי לייצר תרחיף של תא יחיד.
- התאם את הצפיפות ל 2 x 104 תאים / מ"ל (= 1 x 103 תאים לכל 50 μL) על ידי הוספת E-DMEM, ולשמור את התאים על קרח.
- הכן תאי אפקט (כלומר, תאי CD8+ T מופעלים מראש).
- השהה מחדש את התאים בבאר של צלחת 96 בארות (שלב 4.5) ביסודיות על ידי צנרת, והעבר את תאי CD8+ T הצפים לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.
הערה: MAMs ו- M-MDSCs נצמדים היטב לבאר ואינם מנותקים על ידי הפיפט.
- כדי לאסוף את התאים הנותרים, הוסף 200 μL של PBS לתוך הבאר ולהעביר אותו לתוך הצינור בשלב 5.3.1.
- לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של E-DMEM פעם אחת (צנטריפוגה ב 337 x גרם) במשך 5 דקות, לשאוף ולהשליך supernatant), ולהשעות אותם עם 100 μL של E-DMEM.
- ספור את מספר התאים החיים (באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן), התאם את הצפיפות ל- 1.6 x 105 תאים/מ"ל (= 4 x 103 תאים / 25 μL), ושמור את התאים על קרח.
- שאפו את מטריצת קרום המרתף מכל באר של הצלחת בשלב 5.1.
- הוסף 1 x 103 תאים/50 μL של תאי מטרה (שלב 5.2.4) לכל באר וערבב היטב.
הערה: כדי למנוע השפעות קצה עקב אידוי של המדיום, רק 60 בארות פנימיות של צלחת 96 באר צריך לשמש לניתוח.
- הוסף 25 μL של E-DMEM כולל 4 x 10,3 U/mL IL-2 ו- 10 μM מצע קספאז-3 פלואורוגני (עיין בטבלת חומרים).
- הוסף 4 x 103 תאים / 25 μL של תאי T CD8+ (שלב 5.3.4) לבארות מתאימות וערבב היטב.
הערה: נוכחותם של תאים רבים מדי בבאר מקשה על הניתוח. במודל זה, יחס השפעה של 4:1: מטרה (מספר תא כולל 5 x 103 תאים / באר) היה אופטימלי, אך יחס של 8:1 היה תת-אופטימלי. בארות המכילות את ארבעת הפקדים הבאים נחוצות כדי לסייע בניתוח נתונים: תאי מטרה בצפיפות המשמשת לבארות תרבית משותפת (1 x 103 תאים / באר) בתווך עם וללא מצע קספאז-3, תאי אפקט (1 x 103 תאים / באר) בתווך עם וללא מצע קספאז-3.
- הוסף 200 μL של PBS או מים סטריליים לכל הבארות הריקות (במיוחד בארות בשולי הצלחת) כדי להפחית אידוי של תווך מבארות ניסיוניות.
- מקמו את הצלחת במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהילוך מהיר שנשמר בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
הערה: נערו את הצלחת בתבנית צולבת כדי לפזר את כל התאים באופן שווה, ולאחר מכן הניחו לצלחת להישאר בטמפרטורת החדר על משטח שטוח למשך 10-20 דקות לפני העברתה לאינקובטור.
6. הדמיה של התאים
הערה: הגדרות מפורטות של רכישת תמונה ישתנו בהתאם למיקרוסקופ ולפלואורופורים שבהם נעשה שימוש; יש להשתמש בפרמטרי הרכישה הכלליים הבאים לקבלת תוצאות מיטביות.
- באמצעות שגרת מיקוד אוטומטי מתאימה במיקרוסקופ, קבל תמונות המכסות לפחות 25% משטח הפנים הכולל בכל באר ניסוי של לוח 96 בארות.
- הגדר את המיקרוסקופ לקבלת תמונות בניגודיות פאזה, כמו גם תעלה פלואורסצנטית המתאימה לחלבון פלואורסצנטי אדום מוגבל גרעינית (mKate2) ותעלה פלואורסצנטית המתאימה למצע קספאז-3 פעיל פלואורוגני ירוק (עם עירור ב 488 ננומטר) (איור 2).
- צלם תמונות בבארות ניסיוניות בניגודיות פאזה וב-2 תעלות פלואורסצנטיות כל שעה עד שלוש שעות למשך 72 שעות לפחות.
