הערכת ההפעלה של קספזות מרובות במקרופאגים

תקציר

מקור: Han, J. et al., Evaluation of Caspase Activation to Assessment Birth Immune Cell Death.J. Vis. Exp.(2023)

סרטון זה מדגים את ההערכה של הפעלות קספז מרובות במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות גירוי עם נגיף השפעת. בעקבות ליזה מקרופאגים, נטרול חום של ליזט וצנטריפוגה, נאספים קספזות תוך תאיות לניתוח חיסוני עוקב.

פרוטוקול

1. הכנת הפתרונות

1. הכינו מדיה מותנית L929.
   1. לוח 1 × 10⁶ תאי L929 (ראה טבלת חומרים) בבקבוק תרבית^{רקמה בגודל 182} ס"מ 2 המכיל 50 מ"ל של מצע תרבית L929 (ראה טבלה 1 להכנת המדיה).
   2. לגדל את התאים באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% פחמן דו חמצני, CO₂.
   3. לאחר 7 ימים, לאסוף את supernatant, ולסנן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. הכן 50 מ"ל aliquots (לאחסן aliquots קפוא ב -80 ° C עד 1 שנה).
2. הכינו 500 מ"ל של תרבית מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) (טבלה 1).
3. הכינו 500 מ"ל של אמצעי גירוי BMDM (טבלה 1).
4. הכינו 500 מ"ל של מדיה לזיהום (טבלה 1).
5. הכינו 100 מ"ל של חיץ 1 M Tris (טבלה 1).
6. הכינו חיץ 4x נתרן דודציל סולפט (SDS) (טבלה 1).
7. הכינו 1 מ"ל של 1 מ"ל 1,4-dithiothreitol (DTT, טבלה 1).
8. הכינו 40 מ"ל של חיץ קספז ליזיס (טבלה 1).
9. הכינו 100 מ"ל של חיץ טריס באורך 1.5 מ' (טבלה 1).
10. הכן 100 מ"ל של תמיסת SDS של 10% (wt/vol) (טבלה 1).
11. הכינו 50 מ"ל של חיץ 2x radiimmunoprecipitation assay (RIPA) (טבלה 1).
12. הכינו ליפופוליסכריד 5 מ"ג/מ"ל, תמיסת LPS (טבלה 1).
13. הכינו תמיסת ATP אדנוזין טריפוספט באורך 0.5 מ' (טבלה 1).
14. הכינו את פתרונות הכתמים המערביים.
    1. הכינו 1 ליטר של מלאי חיץ פועל פי 5 (טבלה 1).
    2. הכן 1 ליטר של מלאי מאגר העברה 10x (טבלה 1).
    3. הכינו 1 ליטר של מלח חוצץ טריס עם Tween 20 (TBST, טבלה 1).
    4. הכינו 100 מ"ל של תמיסת חסימת חלב רזה 5% (wt/vol) (טבלה 1).
15. הכן את פתרונות הנוגדנים העיקריים.
    1. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-1 (טבלה 1).
    2. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-11 (טבלה 1).
    3. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-3 (טבלה 1).
    4. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-7 (טבלה 1).
    5. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-8 (טבלה 1).
    6. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני קספאז-9 (טבלה 1).
    7. הכינו 10 מ"ל של נוגדן ראשוני β-אקטין מצומד HRP (טבלה 1).
16. הכן את פתרונות הנוגדנים המשניים.
    1. הכינו 10 מ"ל של נוגדן משני נגד ארנבים (טבלה 1).
    2. הכינו 10 מ"ל של נוגדן משני נגד עכבר (טבלה 1).
    3. הכינו 10 מ"ל של נוגדן משני נגד חולדות (טבלה 1).

2. בידוד מקרופאגים שמקורם במח עצם

הערה: עבור פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בעכברי בר בני 6-10 שבועות עם מסלולי מוות תאי מתוכנת שלם (PCD) או עכברים מוטנטיים עם מווסתי PCD, משפיעים או מולקולות בעלות עניין שנמחקו או שונו.

1. הרדימו עכבר בתא CO₂ עם קצב זרימה המחליף 10%-30% מנפח הכלוב לדקה למשך 2-3 דקות. לאחר מכן, בצע המתת חסד משנית, כגון פריקת צוואר הרחם. פעל בהתאם לכל ההנחיות והתקנות הספציפיות למתקן, למוסד ולממשלה בכל מקום רלוונטי.
2. נתחו את העכבר כדי לאחזר את עצמות הרגליים האחוריות.
   1. נעצו את העכבר על גבו כך שהבטן תהיה חשופה. יש לרסס אתנול 70% (vol/vol) כדי לעקר את הרגליים האחוריות והבטן.
      זהירות: אתנול הוא דליק. יש להרחיק אותו מאש גלויה.
   2. השתמש מספריים כדי לבצע חתך בקו האמצע של הבטן; להמשיך לחתוך לכיוון הרגליים כדי להפוך את עצם הירך גלוי.
   3. קח את הרגל האחורית הימנית ומשוך את העור מהגוף לכיוון קו האמצע. לנתק את הרגל מהגוף על ידי קטיעת שרירי adductor לכיוון קו האמצע; לאחר מכן, חתכו את הרגל בין מפרק הירך לעמוד השדרה. לאחר מכן, חתכו את הכף מהדיסטלית לקרסול, והסירו רקמה עודפת מהעצם על ידי קילוף העור ושימוש במספריים פתוחים מעט כדי לפשוט את רקמת השוק.
   4. מניחים את הרגל על מגבת ספוגה אתנול 70% (vol/vol) ומנתחים את השוקה ואת עצם הירך.
      1. אחזו את השוקה ואת עצם הירך כל אחד עם מערכת נפרדת של מלקחיים. לחץ בעדינות על השוקה כנגד הכיוון הטבעי של מפרק הברך; זה יגרום לטיביה להישבר בברך.
      2. השתמש במלקחיים ובמספריים המנתחים במידת הצורך כדי להסיר את הרקמה התלויה שנותרה. שמור את השוקה לשימוש מאוחר יותר על ידי הנחתה על מגבת ספוגה אתנול.
      3. לאסוף את עצם הירך באותו אופן, על ידי ניתוק הברך.
   5. חזור על שלבים 3 ו -4 לעיל עבור רגל שמאל כדי להסיר אותה מהגוף ולנתח את השוקה ואת עצם הירך.
   6. רססו את העצמות באתנול 70% (vol/vol).
   7. נקו את העצמות על ידי הנחתן על מגבת נקייה 70% (vol/vol) ספוגה באתנול, סחיטת החלק הבשרני במגבת ושפשוף המגבת כנגד העצם כדי להסיר רקמה עודפת.
3. לאחר ששתי עצם הירך ושתי הטיביאס נקיות, רססו את כל ארבע העצמות באתנול 70% (vol/vol). אספו את העצמות בצלחת פטרי סטרילית ושטפו אותן עם 10 מ"ל של תרבית BMDM על ידי ניקוי עדין של המדיה בצלחת.
4. מלאו מזרק 10 מ"ל במדיית תרבית BMDM טרייה 10 מ"ל וחברו מחט 25 גרם.
5. הרימו את השוקה באמצעות מלקחיים; לאחר מכן, חתכו את מפרק הקרסול בזווית ~ 45 מעלות.
6. שוטפים את מח העצם מהשוקה.
   1. החזיקו את השוקה מעל צינור של 50 מ"ל, כאשר הקצה הצר של השוקה מצביע כלפי מטה. מוציאים את המדיה על השוקה מהמזרק המלא.
   2. הכנס את המחט (בעדינות בהתחלה) בקצה העליון של המוח והוציא את המדיה.
   3. הסר את המחט ולאחר מכן הכנס שוב. השתמש בלחיצות קצרות בלחץ גבוה כדי לחלק את המדיה ולהזיז את המחט לתוך המח.
   4. ברגע שהמדיה מתחילה לזרום החוצה מתחתית העצם, השתמשו בלחיצות קצרות בלחץ גבוה כדי להמשיך לשטוף את התאים החוצה. עקוב אחר צבע העצם בתהליך זה, וכאשר העצם לבנה, השליך אותה.
   5. עשה זאת עבור שני tibias.
7. חזור על שלבים 5 ו -6 לעיל עבור עצם הירך, חיתוך במפרק הירך כמו השוקה נחתך במפרק הקרסול. השתמש באותו צינור של 50 מ"ל כדי לאסוף את מדיית התרבית BMDM בזמן שהמח סמוק.
8. לאחר שכל ארבע העצמות נשטפו, שאפו את המח והמדיה מצינור 50 מ"ל למעלה ולמטה 3x דרך מחט 18 G על מזרק 10 מ"ל, שוטפים את הצדדים של הצינור בכל פעם כדי לפזר את המח.
9. כוונן את הנפח הסופי בצינור 50 מ"ל ל- 30 מ"ל באמצעות מדיית תרבית BMDM, וודא שהתאים מושהים היטב.
10. השתמש במסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסנן את מדיית תרבית BMDM מצינור 50 מ"ל.
11. צלחת את תרחיף התא שנוצר, המכיל את תאי האב של מח העצם, לתוך שלוש צלחות תרבית רקמה 150 מ"מ על ידי הוספת 10 מ"ל (או ~ 20 × 10⁶ תאים) לכל אחד. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל נוספים של מדיה תרבית BMDM לכל מנה. לדגור באינקובטור לח ב 37 °C (77 °F).

3. בידול BMDM וציפוי לניסויים

1. לדגור את תאי האב מוח עצם מצופה ב 37 ° C במשך 3 ימים. לאחר מכן, הסר כל מנה, והוסף 5-8 מ"ל נוספים של מדיה תרבית BMDM (טבלה 1). חזור לחממה ב 37 °C (77 °F).
2. ביום 5 לאחר הציפוי הראשוני, מוציאים כל מנה, ומוסיפים 5 מ"ל נוספים של תרבית BMDM. חזור לחממה ב 37 °C (77 °F).
3. ביום השישי, מוציאים כל מנה, ומשליכים את המדיה. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של מי מלח קרים (מאוחסנים ב 4 ° C) פוספט חוצץ (PBS) לשטוף פעם אחת. יש להשליך את 10 מ"ל של שטיפת PBS קרה. לאחר מכן, הוסיפו 10 מ"ל של PBS טרי וקר לכל מנה, ודגרו על כל מנה על קרח במשך 5 דקות.
4. באמצעות מגרד תאים, לגרד בעדינות את התאים מכל שלוש הכלים לתוך צינור אחד 50 מ"ל. סובב בעדינות את התאים ב 270 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות; לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט.
5. הוסף 20 מ"ל של מדיה תרבית BMDM, פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את הכדור, ולספור את התאים.
   הערה: צפוי כי כל עכבר יניב כ 60 × 10 6-100 × ^{10 6} תאים.
6. תכננו את פריסת הלוחות של 12 בארות עבור המבחן הרצוי למוות תאי חוץ גופי/גירוי דלקתי. תכננו צלחת 1 × 10⁶ תאים לכל באר. עבור כל גירוי מתוכנן, כלול לפחות שלושה עותקים ביולוגיים, וצלחת קבוצה אחת של בארות שייקצרו בחיץ קספז ליזיס וקבוצה שנייה של בארות שייקצרו במאגר RIPA.
7. צלחת 1 × 10⁶ תאים ב 1 מ"ל של מדיה תרבית BMDM לכל באר בלוחות 12 באר. תרבית לילה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך להערכת מוות תאים / דלקת. לאחר דגירה לילה, להסיר את התקשורת, ולהוסיף 1 מ"ל של PBS חם (37 ° C) לכל באר כדי לשטוף את התאים.
8. הסר את שטיפת PBS והוסף 500 מיקרוליטר של מדיה לגירוי BMDM עם אנטיביוטיקה (אם אתה מבצע גירויים לא חיידקיים) או מדיה לגירוי BMDM ללא אנטיביוטיקה (אם אתה מבצע גירויים חיידקיים) (טבלה 1). יש לדגור במשך שעתיים לפני המעבר לשלב 4 לגירוי/זיהום חוץ גופי.

4. גירוי או הדבקת התאים

זהירות: החומרים הכלולים בפרוטוקול זה הם פתוגניים פוטנציאליים ויש לטפל בהם באמצעי הזהירות המתאימים במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) עם אישור מהרשויות המוסדיות והממשלתיות הרלוונטיות.

1. לעורר את BMDMs כדי להפעיל מוות התא עם הטריגר של עניין.
   הערה: למטרות פרוטוקול זה, וירוס שפעת A (IAV), וירוס הרפס סימפלקס 1 (HSV1), Francisella novicida, ו- LPS + ATP משמשים להמחשה, אך ניתן להשתמש בטריגרים אחרים.
   1. גירוי לדוגמה 1: הדבקה ב- IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (נבנה לפי הופמן ואחרים; הטיטר הנגיפי לקביעת ריבוי הזיהום [MOI] מחושב על ידי בדיקת פלאק בתאי MDCK):
      1. חשב את נפח הנגיף הדרוש להדבקה בריבוי זיהום (MOI) של 20 יחידות יוצרות פלאק (PFU) באמצעות משוואה (1) ומשוואה (2):
         
         
         
   2. הסר את המדיה מן BMDMs ולשטוף את התאים פעם אחת עם 500 μL של PBS. הוסף 450 μL של IAV (20 MOI) ב- DMEM גלוקוז גבוה ללא סרום בקר עוברי מומת חום, (HI)-FBS לכל באר. יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה באינקובטור לח כדי לאפשר ספיגה.
   3. הסר את הצלחות והוסף 50 μL של HI-FBS. להחזיר את הצלחות לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לדגור בסך הכל 12 שעות.

5. איסוף הסופרנאטנט והחלבון ליזט המשולבים שישמשו לכתמי קספז מערביים

1. לאחר 4 שעות, 12 שעות או 16 שעות של דגירה (העיתוי הספציפי תלוי בהדק בו נעשה שימוש), הסר את הצלחת מהאינקובטור.
2. הסר 150 μL של supernatant; להשליך או לשמור את זה עבור אנליזות supernatant אחרים (למשל, אנזים מקושר immunosorbent assay [ELISA]). אל תסיר את הסופרנטנט שנותר.
3. צור את פתרון איסוף החלבונים על-ידי שילוב של 50 μL של חיץ קספז ליזה + 100 μL של חיץ SDS 4x לכל באר (טבלה 1). לאחר מכן, להוסיף 150 μL של תערובת לכל באר.
4. עבור כל באר, פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לאסוף את התאים lysed ו supernatant. תוך כדי פיפט, גם לגרד את החלק התחתון של הבאר עם קצה פיפטה כדי לשבש את התאים. לאחר גירוד ו pipetting, לאסוף את החלבון lysate לתוך מסומן 1.5 מ"ל צינורות.
5. השתמש בלוק חום כדי לחמם את כל הצינורות ל 100 ° C במשך 12 דקות.
6. גלול כל רכיב בלתי מסיס על ידי צנטריפוגה ב 14,500 × גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
   הערה: זוהי נקודת הפסקה - ניתן להשתמש בחלבון מהסופרנאטנט המשולב והחלבון ליזטים באופן מיידי או לאחסן ב -20 ° C למשך עד חודשיים או ב -80 ° C עד 6 חודשים עד מוכן לשימוש.

קטגוריה	ריאגנטים	הכנה	הערות	אמצעי בטיחות
Media	L929 מדיה תרבותית	1) חימום להשבית FBS (ראה הערות). 2) שלבו 43.5 מ"ל של מדיום דולבקו מעובד של איסקוב (IMDM), 5 מ"ל של נסיוב בקר עוברי מומת בחום (HI-FBS), 0.5 מ"ל נתרן פירובט, 0.5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, ו-0.5 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין.	השבתת חום FBS על ידי דגירה ב 56 ° C למשך 30 דקות.
	מדיית תרבית מקרופאגים ממח עצם (BMDM)	שלב 290 מ"ל של IMDM, 150 מ"ל של מדיה מותנית L929, ו 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מ"ל של HI-FBS, ו 5 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין.	יש לחמם את הטכניקה ל-37°C באמבט מים או חרוזים לפני השימוש. ניתן לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
	מדיה גירוי BMDM עם אנטיביוטיקה	שלב 445 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), 50 מ"ל של HI-FBS, ו -5 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין.	יש לחמם את הטכניקה ל-37°C באמבט מים או חרוזים לפני השימוש. ניתן לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
	מדיה גירוי BMDM ללא אנטיביוטיקה	שלב 450 מ"ל של DMEM ו 50 מ"ל של HI-FBS.	יש לחמם את הטכניקה ל-37°C באמבט מים או חרוזים לפני השימוש. ניתן לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
	מדיה להדבקה (ללא HI-FBS)	שלב 495 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה עם 5 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין.	יש לחמם את הטכניקה ל-37°C באמבט מים או חרוזים לפני השימוש. ניתן לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
מאגר נתרן דודציל סולפט (SDS)	1 מטר Tris buffer (עבור מאגר SDS של 4x)	1) להמיס 12.11 גרם של Tris ב 80 מ"ל של מים deionized. 2) כוונן את ה- pH ל- 6.8 על ידי הוספת טיפות HCl תוך כדי ערבוב. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -100 מ"ל.	ניתן לאחסן את החיץ ב-4°C למשך עד חודש אחד.	HCl הוא סיבתי. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. HCl צריך להיות מטופל במכסה אדים.
	4x מאגר SDS	1) ערבבו 60 מ"ל של תמיסת 1 M Tris (pH 6.8), 24 מ"ג SDS, 100 מ"ג ברומופנול כחול, 120 מ"ל גליצרול, 8.4 מ"ל β-מרקפטואתנול (BME) ו-90 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. 2) מערבבים על צלחת ערבוב מחממת כדי לאפשר למלחים להיכנס לתמיסה. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -300 מ"ל.	ניתן לאזן את החיץ ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.	SDS הוא קאוסטי, ו-BME הוא מסרטן. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. SDS ו- BME צריכים להיות מטופלים במכסה מנוע.
Caspase lysis buffer	1 מטר 1,4-dithiothreitol (DTT)	יש להמיס 0.154 גרם אבקת DTT ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). אפשר ל-DTT להיכנס לפתרון.	חיץ יכול להיות aliquoted לתוך 200 μL aliquots ומאוחסן ב -20 ° C עד 1 שנה.
	חיץ קספז ליזיס	ערבבו 35 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה, 4 מ"ל של NP-40, 750 מיקרוליטר של 1 M DTT, טבליה אחת של מעכב פרוטאז וטבליה אחת של מעכב פוספטאז.	ניתן לאחסן את החיץ ב-4°C למשך עד חודש אחד.
מאגר בדיקות משקעים רדיואימוניות (RIPA)	1.5 מטר Tris buffer (עבור מאגר RIPA)	1) להמיס 18.2 גרם של Tris ב 80 מ"ל של מים deionized. 2) כוונן את ה- pH ל- 8.8 על ידי הוספת טיפות NaOH תוך כדי ערבוב. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -100 מ"ל.	ניתן לאחסן את החיץ ב-4°C למשך עד חודש אחד.	NaOH הוא חומר מאכל ועלול לגרום לכוויות. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות.
	10% (wt/vol) פתרון SDS (עבור מאגר RIPA)	1) הוסף 10 גרם SDS ל 80 מ"ל של מים deionized. 2) מערבבים עד להמסה. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -100 מ"ל.	הפתרון ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. אם התמיסה שוקעת, חממו בעדינות כדי להתמוסס מחדש.	SDS הוא קאוסטי. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. SDS צריך להיות מטופל במכסה אדים.
	RIPA buffer (מלאי פי 2)	1) ערבבו 0.5 גרם נתרן דאוקסיכולאט, 1 מ"ל NP-40, 0.876 גרם NaCl, 3.3 מ"ל של 1.5 M Tris (pH 8.8), ו-1 מ"ל של 10% (wt/vol) SDS ב-46 מ"ל מים נטולי יונים. 2) מערבבים עד להמסה. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -50 מ"ל.	ניתן לאחסן 2x RIPA ב 4 ° C עד חודש אחד.	SDS הוא קאוסטי. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. SDS צריך להיות מטופל במכסה אדים.
Sterile triggers	LPS	יש להמיס LPS שעבר ליופיליזציה מ-E. coli 0111:B4 במים נטולי אנדוטוקסין לריכוז של 5 מ"ג/מ"ל.	ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנתיים.
	0.5 מטר ATP	להמיס 1 גרם של ATP lyophilized ב 3.63 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין.	הפתרון יכול להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C עד 2 שנים.
פתרונות הכתמה מערביים	חיץ ריצה (פי 5 מלאי)	1) ערבבו 15 גרם בסיס טריס, 72 גרם גליצין ו-5 גרם SDS ב-900 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. 2) מערבבים עד שלא נשארים חלקיקים. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -1 ליטר.	ניתן לאחסן את החיץ בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.	SDS הוא קאוסטי. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. SDS צריך להיות מטופל במכסה אדים.
	מאגר העברות (מלאי פי 10)	1) ערבבו 30.3 גרם בסיס טריס ו-72 גרם גליצין ב-900 מ"ל מים נטולי יונים. 2) מערבבים עד שלא נשארים חלקיקים. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל -1 ליטר.	ניתן לאחסן את החיץ בטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.
	מלח חוצץ טריס עם Tween 20 (TBST)	1) להמיס 2.42 גרם של בסיס Tris ו 8.76 גרם של NaCl ב 850 מ"ל של מים deionized. 2) כוונן את ה- pH ל- 7.4 על ידי הוספת טיפות HCl תוך כדי ערבוב. 3) הוסף מים נטולי יונים, כדי להתאים את הנפח הסופי ל- 1 L. 4) הוסף 0.5 מ"ל של Tween 20 (ריכוז סופי של 0.05% (vol/vol)).	ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד.	HCl הוא סיבתי. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים; זה יכלול מעיל מעבדה וכפפות. HCl צריך להיות מטופל במכסה אדים.
	תמיסת חסימת חלב רזה 5% (WT/VOL)	יש להמיס 5 גרם אבקת חלב מיובש ללא שומן ב-100 מ"ל TBST.	הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 °C עד 1 שבוע.
נוגדנים ראשוניים	קספאז-1 נוגדן ראשוני	לדלל את נוגדן anti-caspase-1 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של הנוגדן ל 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	קספאז-11 נוגדן ראשוני	לדלל את נוגדן אנטי-קספאז-11 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של הנוגדן ל 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	קספאז-3 נוגדן ראשוני	לדלל את הנוגדן נגד קספאז-3 ואת הנוגדן נגד קספאז-3 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של כל נוגדן לאותו 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	קספאז-7 נוגדן ראשוני	יש לדלל את הנוגדן נגד קספאז-7 ואת הנוגדן נגד קספאז-7 ביחס 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של כל נוגדן לאותו 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	קספאז-8 נוגדן ראשוני	לדלל את הנוגדן נגד קספאז-8 ואת הנוגדן נגד קספאז-8 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של כל נוגדן לאותו 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	קספאז-9 נוגדן ראשוני	לדלל את נוגדן אנטי-קספאז-9 1:1,000 (vol/vol) על ידי הוספת 10 μL של הנוגדן ל 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו חומר רענן לכל ניסוי. עם זאת, פתרון זה ניתן להשתמש לפחות 3 פעמים ללא אובדן יעילות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C בשימוש חוזר.
	נוגדן ראשוני מצומד β-אקטין	לדלל את נוגדן אנטי-β-אקטין 1:5,000 (vol/vol) על ידי הוספת 2 μL של הנוגדן ל 10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	נוגדן זה צריך להיות מוכן טרי לכל ניסוי.
נוגדנים משניים	נוגדן נגד ארנב	לדלל את הנוגדן המשני המצומד 1:5,000 (vol:vol) על ידי הוספת 2 μL של הנוגדן ל-10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	דילול הנוגדנים צריך להיות מוכן טרי בכל פעם.
	נוגדן נגד עכבר	יש לדלל את הנוגדן המשני המצומד HRP בקנ"מ 1:5,000 (vol:vol) על ידי הוספת 2 μL של הנוגדן ל-10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	דילול הנוגדנים צריך להיות מוכן טרי בכל פעם.
	נוגדן נגד חולדות	יש לדלל את הנוגדן המשני המצומד HRP בקנ"מ 1:5,000 (vol:vol) על ידי הוספת 2 μL של הנוגדן ל-10 מ"ל של 5% (wt/vol) תמיסת חסימת חלב רזה.	דילול הנוגדנים צריך להיות מוכן טרי בכל פעם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנן 0.45 מיקרומטר	מיליפור	SCHVU05RE
מזרק 10 מ"ל	BD Biosciences	309604
צלחת 12 בארות	קורנינג	07-200-82
18 גר' מחט	BD Biosciences	305195
25 גר' מחט	BD Biosciences	305122
צינור 50 מ"ל	פישר סיינטיפיק	50-809-218
מסננת תאים 70 מיקרומטר	קורנינג	431751
כלי תרבית רקמה 150 מ"מ	קורנינג	430597
בקבוק תרבית רקמה 182 סמ"ר	ג'נסי סיינטיפיק	25-211
ATP	InvivoGen	TLRL-ATPL
BBL טריפטיקזה מרק סויה	BD Biosciences	211768
אמבט חרוזים	כימגלס מדעי החיים	CLS-4598-009
ביופוטומטר D30	אפנדורף	6133000010
מגרדי תאים	CellTreat מוצרים מדעיים	229315
תא CO2	VetEquip	901703
קובטות	פישר סיינטיפיק	14-955-129
ניתוח מספריים	תרמו פישר סיינטיפיק	221S
DMEM	תרמו פישר סיינטיפיק	11995-073
אתנול	פארמקו	111000200
סרום בקר עוברי	ביוווסט	S1620
נייר סינון	ביו-ראד	1703965
מלקחיים	פישר סיינטיפיק	22-327379
Francisella novicida (זן U112)	משאבים עבור BEI	NR-13
ג'נטמיצין	גיבקו	15750060
בלוק חום	פישר סיינטיפיק	23-043-160
וירוס הרפס סימפלקס 1 (זן HF)	ATCC	VR-260
DMEM גלוקוז גבוה	סיגמא	D6171
אינקובטור לח	תרמו פישר סיינטיפיק	51026282
IMDM	תרמו פישר סיינטיפיק	12440-053
נגיף שפעת A (A/פורטו ריקו/8/34, H1N1 [PR8])	נבנה לפי הופמן ואחרים.
תאי L929	ATCC	CCL-1	קו תא ליצירת מדיה מותנית L929
ל-ציסטאין	תרמו פישר סיינטיפיק	BP376-100
תאי MDCK	ATCC	CCL-34	קו תאים לקביעת טיטר נגיפי IAV
מיקרוצנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק	75002401
חומצות אמינו לא חיוניות	גיבקו	11140050
פתרון NP-40	סיגמא	492016
PBS	תרמו פישר סיינטיפיק	10010023
פניצילין וסטרפטומיצין	סיגמא	עמ' 4333
צלחת פטרי	פישר סיינטיפיק	07-202-011
פוסטופ	רוש	פוס-רו
מקור מתח	ביו-ראד	164-5052
טבליה מעכבת פרוטאז	סיגמא	S8820
נתרן הידרוקסידי	סיגמא	72068
נתרן פירובט	גיבקו	11360-070
צלחת פטרי מרובעת	פישר סיינטיפיק	FB0875711A
צנטריפוגה שולחנית	תרמו פישר סיינטיפיק	75004524
ליפופוליסכריד אולטרה-טהור (LPS) מאי-קולי 0111:B4	InvivoGen	TLRL-3PELPS
תאי Vero	ATCC	CCL-81	קו תאים לקביעת טיטר נגיפי HSV1