$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. ניתוח ציטוקינים מדמעות
- אוסף הדמעות:
- בקשו מהנבדק לשבת בנוחות על כיסא בחינה ולהניח את ראשו כנגד משענת הראש.
- בקשו מהנבדק להרים את מבטו, פתחו בזהירות את רצועות שירמר (עשויות מנייר פילטר מס' 41), הניחו את הקצה המעוגל של הרצועה על הפורניקס התחתון של העין, והורו לנבדק לעצום את העיניים למשך 5 דקות. בעת איסוף הדמעות יש להקפיד מאוד למזער את המגע עם פני העין.
- בקשו מהנבדק לפקוח את עיניו כדי להסיר את הרצועה ולמקם אותה בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. מיד להעביר את הצינור למעבדה או לאחסן אותו ב -80 oC עד בדיקת פרופיל ציטוקינים.
- הוצאת דגימת דמעות מרצועת זרימת הדמעות:
- חתכו את רצועת זרימת הדמעות לאורך של 0.5 ס"מ (כדי לתקנן את כמות הדמעות שיש לבדוק) והניחו אותה בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל.
- הוסף 30 μL של חיץ הבדיקה ודגר בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב 14,000 x גרם במשך 1 דקה.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף בנפח 1.5 מ"ל ומשליכים את הרצועה. הניחו את הדגימה המכילה את הצינורית על קרח והשתמשו מיד בדגימת הדמעות המדוללות לצורך יצירת פרופיל ציטוקינים.
- הכנת ריאגנטים:
הערה: ארבעים ואחד האנליטים שייבדקו בכל דגימה באמצעות בדיקת מולטיפלקס מבוססת חרוזים הם אינטרלוקין (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, אינטרפרון-אלפא (IFN- α) 2, IFN-γ, חלבון IFN-גמא 10 (IP-10, CXCL10), כימוקין נגזר מקרופאגים (MDC), חלבון דלקתי מקרופאגים (MIP)-1α ו-MIP-1β, חלבון כימוטקטי מונוציטים (MCP)-1, MCP-3, גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α), TNF-β, אונקוגן מווסת גדילה (GRO), גורם גדילה גידולי אלפא (TGF-α), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), גורם גדילה אפידרמיס (EGF), גורם גדילה פיברובלסטים (FGF)-2, גורם גדילה נגזר טסיות (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF), גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, ליגנד CD40 מסיס (sCD40L), ליגנד טירוזין קינאז 3 דמוי Fms (Flt-3L) ומווסת עם הפעלתו, חלבון תקין מבוטא ומופרש תאי T (RANTES).
- הביאו את בקבוקוני תמיסת חרוזי הנוגדנים (50X) לטמפרטורת החדר (20 – 25 מעלותצלזיוס) וערבבו את הבקבוקונים למשך דקה.
- ספרו את מספר הבארות הדרושות לבדיקה, וחשבו את כמות תמיסת קוקטייל חרוזי הנוגדנים הכוללת (25 מיקרוליטר לבאר) וכל תמיסת חרוזי נוגדנים (פי 50) הנדרשת לבדיקה.
- הכינו את תמיסת הקוקטייל על ידי הוספת הכמות המחושבת של כל תמיסת חרוזי נוגדנים ומלאו לנפח הסופי הרצוי על ידי הוספת הכמות הנותרת של מדלל חרוזים. ודא כי הריכוז הסופי של כל נוגדן בקוקטייל הוא 1X. תמיד להכין לפחות 20% נפח נוסף של תמיסת קוקטייל במקרה של שגיאות pipetting.
הערה: לדוגמה, עבור בדיקה 96-well להכין 3000 μL של נוגדנים חרוז קוקטייל פתרון. הכמות הנדרשת של כל תמיסת חרוזי נוגדנים = ריכוז 3000/מלאי של כל תמיסת חרוזי נוגדנים; 3000/50 = 60 μL של כל תמיסת חרוזי נוגדנים
- הוסף 60 μL של כל אחת מ -41 תמיסות חרוזי נוגדנים (60 X 41 = 2460 μL) לבקבוק קוקטייל והוסף 540 μL של תמיסת דילול חרוזים לתערובת חרוזי הנוגדנים כדי ליצור 3000 μL של פתרון עבודה סופי (1X).
- לפני השימוש, ערבבו כראוי את תמיסת קוקטייל החרוזים. לאחר הבדיקה לאחסן את הנפח הנותר ב 2-8 oC עד 30 ימים.
- הכן את בקרות האיכות (QC) על ידי הוספת 250 μL מים נטולי יונים, למלאי QC 1 ו- QC 2.
- מערבבים כראוי על ידי היפוך הבקבוקים מספר פעמים ומערבול במשך 10 שניות. העבר את הפתרון לצינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן מסומנים כראוי ולאחסן את הפתרון הנותר ב -20 oC אשר ניתן להשתמש עד 30 ימים.
- הכינו את חיץ הכביסה על ידי הוספת 270 מ"ל מים נטולי יונים, ל-30 מ"ל של תמיסת חיץ כביסה 10X, וערבבו היטב (לפני הדילול, הביאו את מאגר ה-10X לטמפרטורת החדר והמיסו את כל משקעי המלח על ידי ערבוב). אחסנו את מאגר הכביסה שאינו בשימוש (1X) בטמפרטורה של 2-8 מעלותצלזיוס, שניתן להשתמש בה עד 30 יום.
- הכינו את מלאי הציטוקינים האנושי הסטנדרטי (10,000 pg/mL של כל האנליטים) על ידי הוספת 250 μL מים נטולי יונים, לבקבוקון המלאי. מערבבים היטב על ידי היפוך מספר פעמים ומערבול הבקבוקון למשך 10 שניות. אפשר לו לעמוד במשך 10 דקות ולהעביר את פתרון המניות לצינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן מסומנים כראוי. לאחר הבדיקה, לאחסן את הפתרון הנותר ב -20 oC, אשר ניתן להשתמש עד 30 ימים.
- הכן את תקני הציטוקינים האנושיים העובדים על ידי דילול סדרתי פי 5 (50 μL -> 200 μL) עם חיץ בדיקה כדי לקבל 2000, 400, 80, 16 ו- 3.2 pg/mL.
- לאחר הכנת התקן, השתמש בתקני העבודה תוך 60 דקות והשתמש במאגר הבדיקה כריק/רקע (-pg/mL).
- פרופיל ציטוקינים על ידי בדיקת מולטיפלקס מבוססת חרוזים:
- הביאו את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר ולמערבולת למשך 5-10 שניות לפני הוספתם לצלחת מיקרוטיטר 96 בארות. אם דגימות הדמעות המדוללות מאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלותצלזיוס לפני הבדיקה, הפשירו את תמציות הדמעות הקפואות על קרח וצנטריפוגה בטמפרטורה של 1000 X גרם למשך 5 דקות.
- הכן גליון עבודה של בדיקה בתצורה אנכית לעבודה של תקני ציטוקינים אנושיים [0 (ריק), 3.2, 16, 80, 400, 2,000 ו- 10,000 pg/mL], QC1, QC2 ודגימות.
- הוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה 1X לכל באר של הצלחת, אטמו אותה עם אוטם צלחת, ושמרו על שייקר צלחות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלותצלזיוס) למשך 10 דקות.
- דקרו את חיץ הכביסה 1X על ידי היפוך הצלחת והדבקתה על מגבות סופגות מספר פעמים כדי להסיר כמות שיורית של חיץ כביסה בבארות.
- הוסף 25 μL של כל תקן ציטוקינים אנושי עובד, QC1, QC2, ריק (מאגר בדיקה), ודגימות לתוך הבארות המתאימות.
- הוסף 25 μL של חיץ assay לתוך כל באר.
- הוסיפו 25 μL של תמיסת קוקטייל חרוזי נוגדנים 1X לכל באר. מכיוון שתמיסת חרוזי הנוגדנים רגישה לאור, אטמו את הצלחת עם אוטם פלטות וכסו אותה ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור במהלך הבדיקה.
- לדגור על הצלחת ב 4 oC לילה על שייקר.
- הניחו את הצלחת על מתלה הצלחות של מכונת כביסה מגנטית אוטומטית. תן לו לשבת במשך דקה אחת כדי ליישב את החרוזים המגנטיים בתחתית הבאר ולשאוף את תוכן הבאר. מוסיפים 200 μL של חיץ כביסה לכל באר, נותנים לו לשבת במשך דקה אחת ולאחר מכן שואפים את תכולת הבאר. חזור על הכביסה פעם נוספת (לשטיפת צלחות, פעל בהתאם להוראות יצרן הערכה).
- מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לגילוי לכל באר, אוטמים את הצלחת, מכסים אותה ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות על שייקר.
- מוסיפים 25 μL של תמיסת סטרפטאווידין-פיקואריתרין לכל באר, אוטמים את הצלחת, מכסים אותה ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר.
- הניחו את הצלחת על מכונת כביסה מגנטית. תן לו לשבת במשך דקה אחת ולאחר מכן לשאוף את תוכן הבאר. הוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל באר. תן לו לשבת במשך דקה אחת ולאחר מכן לשאוף את תוכן הבאר. חזרו על הכביסה פעם נוספת.
- הוסיפו 150 מיקרוליטר נוזל נדן לכל באר והניחו את הצלחת על שייקר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להשהות מחדש את חרוזי הנוגדנים.
- קרא את הצלחת באופן מיידי באמצעות קורא לוחות בדיקת מולטיפלקס מבוסס חרוזים ונתח את ריכוזי הציטוקינים באמצעות אלגוריתם התאמת עקומה בן 5 פרמטרים. דיאגרמת זרימה סכמטית של פרופיל ציטוקינים מדמעות מוצגת באיור 1.
- קריאת לוחית הבדיקה (הגדרת המכשיר) וניתוח נתונים:
- הפעל את קורא בדיקות המולטיפלקס מבוסס החרוזים וחמם מראש את הלייזר למשך 30 דקות.
- הפעל את תוכנת בדיקת המולטיפלקס מבוססת החרוזים. תחת הכרטיסייה 'תחזוקה אוטומטית', בחרו באפשרות 'כיול-אימות'. מערבלים כל בקבוקון מגיב של חרוזי הכיול והאימות למשך 30 שניות. הכניסו 5 טיפות מכל מגיב לבארות המיועדות. מלאו את המאגרים הייעודיים במים נטולי יונים, ו-70% אתנול.
