שימוש בהכלאה פלואורסצנטית של Immuno-RNA באתרו כדי להמחיש את SARS-CoV-2

תקציר

מקור: Kula-Pacurar, A., et al. הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות RNA-Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (166), (2020).

סרטון זה מדגים את היישום של תגובת שרשרת הכלאה (HCR)-Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) להדמיית ההתפלגות המרחבית של RNA תת-גנומי SARS-CoV-2. לשילוב HCR עם טכניקות אימונופלואורסנציה יש פוטנציאל לספק תובנות לגבי אינטראקציות בין נגיף המאכסן ברמת התא היחיד.

פרוטוקול

1. SARS-CoV-2 RNA-FISH בתאי Vero בתרבית על כיסויים

DAY 1

1. תיקון וחדירה של תאים
   1. תקן תאים נגועים עם תמיסת PFA של 3.7% w/v למשך שעה אחת ב- RT.
   2. שאפו לתמיסת PFA של 3.7%, ושטפו את התאים פעמיים באמצעות PBS 1x.
   3. חדרו את התאים עם תמיסת PBST למשך 10 דקות ב- RT עם תסיסה.
   4. שאפו את PBST, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS 1x.
2. זיהוי
   1. שאפו את תמיסת PBS 1x, ושטפו את התאים פעמיים עם 2x SSC ב-RT.
   2. שאפו את פתרון 2x SSC, ובצעו הכלאה מראש של הדגימות על ידי הוספת לפחות 300 μL של חיץ הכלאה של בדיקה. מכסים את הבארות המכילות את התאים, ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   3. הכן את תמיסת הבדיקה על ידי הוספת 1.2 pmol של תערובת בדיקה למאגר הכלאת הגשושית.
      1. השתמש ב- 1.2 μL של מלאי הבדיקה 1 μM כדי להכין 300 μL של מלאי עובד.
   4. מוציאים את תמיסת הפרה-הכלאה ומעבירים את הכיסויים לתא לח.
      1. פיפטה 30-50 μL של תמיסת בדיקה על פרפילם ליצירת טיפות בודדות.
   5. לדגור את הדגימות לילה (12-18 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס.

יום 2

1. העבירו את הכיסויים בחזרה לצלחת בת 12 בארות, והסירו את תמיסת הבדיקה העודפת על ידי שטיפה במשך 4 x 5 דקות עם 400 μL של חיץ שטיפת בדיקה בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: כחלופה להנחת 30-50 μl aliquots על parafilm ומתחת coverslips עבור הדגירה, להוסיף 300 μL של תמיסת בדיקה ישירות לכיסויים בצלחת 12 בארות. הליך זה הוא פשוט יותר אבל דורש כמויות משמעותיות של ריאגנטים. חממו את מאגר שטיפת הבדיקה לטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. חשב את כמות החיץ הדרושה, והעבר אותו לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל.
2. שטפו דוגמיות במשך 2 x 5 דקות עם 5x SSCT ב-RT.
3. החלף את פתרון 5x SSCT ב- 1x PBS, ואחסן את הדגימות ב- 4 ° C עד להגברה.

3. הגברה

1. הסר את תמיסת PBS 1x מהבארות, והוסף לפחות 300 מיקרוליטר של חיץ הגברה לכל באר. דגרו על הדגימות במשך 30 דקות ב-RT.
2. הכינו כל סיכת HCR (h1 ו-h2) על-ידי קירור מהיר של הנפח הרצוי בצינורות נפרדים.
   1. כדי להכין 300 μL של תמיסת הגברה, השתמש 18 pmol של כל סיכת ראש (למשל, עבור 300 μL, השתמש 6 μL של 3 μM תמיסת סיכת ראש סטוק).
   2. מעבירים את תמיסת סיכת השיער לצינורות.
   3. לדגור ב 95 ° C במשך 90 שניות.
   4. מצננים ל-RT למשך 30 דקות בחושך.
3. הכינו תערובת סיכות ראש על ידי הוספת סיכות השיער "h1" ו-"h2" מקוררות בהצמדה למאגר ההגברה.
4. יש לטפטף טיפות של 30-50 מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על פרפילם.
5. דגרו על הדגימות במשך הלילה (12-18 שעות) בחושך ב-RT.

יום 3

6. העבירו את הכיסויים בחזרה לצלחת בעלת 12 הקידוחים, והסירו סיכות שיער עודפות על ידי שטיפה במשך 5 x 5 דקות עם 5x SSCT ב-RT עם תסיסה.
7. שאפו את מאגר 5x SSCT והחלף אותו ב-1x PBS.
   הערה: במידת הצורך, השתמש בדגימות RNA-FISH בבדיקת immunofluorescence סטנדרטית, ולאחר מכן צביעת גרעינים (ראה סעיף 1.4).

4. צביעה גרעינית והרכבה על שקופיות

1. שאפו את תמיסת 1x PBS, והחליפו אותה ב-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת PBS אחת.
2. דגרו על הדגימות במשך 10 דקות ב- RT בחושך.
3. שאפו את תמיסת DAPI, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS 1x.
4. הניחו שתי טיפות של 10 μL כל אחת של אמצעי הרכבה; ודאו שהטיפות מופרדות מספיק כדי לאפשר הנחת שני כיסויים על מגלשה אחת.
5. הסר את עודפי הנוזלים על ידי הקשה על הכיסויים על מגבת נקייה, ולאחר מכן הנח אותם בתווך הרכבה נגד דהייה כאשר התאים פונים כלפי מטה.
6. הניחו את הדגימות המותקנות על משטח יבש ושטוח בחושך ותנו להן להירפא.
7. לאחר הריפוי, אטמו את שולי הכיסויים עם חומר איטום VALAP או לק כדי למנוע מהדגימות להתייבש.

2. SARS-CoV-2 RNA-FISH בתרבויות HAE

DAY 1

1. תיקון וחדירה של תרבות HAE
   1. שאפו את המדיום, וקבעו את התאים הנגועים באמצעות תמיסת PFA של 3.7% למשך שעה אחת ב- RT.
   2. שאפו לתמיסת PFA של 3.7%, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS אחד.
      1. החלף את פתרון ה-PFA 3.7% ב-PBS אחד תחת תוספת Transwell.
   3. יש להשליך את ה-PBS ולייבש את הדגימות באמצעות שטיפות של 2 x 5 דקות עם 100% MeOH מקורר מראש ל-20°C-.
   4. לאחר השטיפה השנייה, החליפו את החיץ ב-MeOH טרי ומצונן לחדירה מתחת לתוספת Transwell. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של -20°C.

יום 2

2. Rehydration
   יש לייבש מחדש את הדגימות באמצעות סדרה מדורגת של תמיסות MeOH/PBST (כל אחת למשך 5 דקות) על קרח: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS ו-100% PBST (פעמיים).
   1. שטפו את התאים במשך 5 דקות על קרח עם 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. שטפו תאים במשך 5 דקות על קרח עם 5x SSCT.
   3. החלף את מאגר SSCT 5x ב- PBS אחד.
3. זיהוי
   1. יש לדגור על התאים (בתוך עלון הטרנסוול) במשך 5 דקות על קרח עם 100 מיקרוליטר של חיץ הכלאה של הגשושית. לאחר מכן, להעביר את הצלחת לאינקובטור במשך 30 דקות ב 37 ° C (prehybridization).
      הערה: יש לחמם מראש את חיץ הכלאת הבדיקה ל-37°C לפני השימוש. חשב את הנפח הנדרש: 100 μL נדרש עבור תוספת Transwell אחת.
   2. הכינו את פתרון הבדיקה. מכיוון ש- 1 מ"ל של תמיסת בדיקה דורש 4 pmol של בדיקה, הוסף 4 μL של 1 מיקרומטר תמיסת מלאי בדיקה ל- 1 מ"ל של חיץ הכלאת בדיקה, וערבב היטב.
      הערה: לזיהוי RNA, השתמש ב- 100 μL של תמיסת בדיקה לכל החדרת Transwell. השאירו את תמיסת הגשושית על הקרח עד סוף שלב טרום ההכלאה.
   3. הסר את פתרון קדם-הכלאה והוסף את פתרון הבדיקה.
   4. לדגור על התאים לילה (12-18 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס.

יום 3

5. יש להסיר את עודפי הבדיקה על-ידי שטיפה במשך 4 x 15 דקות עם 100 μL של חיץ שטיפת בדיקה ב-37°C.
6. שטפו את הדגימות במשך 2 x 5 דקות עם 5x SSCT ב- RT.
7. החלף את 5x SSCT ב- 1x PBS, ואחסן את הדגימות ב- 4 ° C עד להגברה.

4. הגברה

1. הגבירו מראש את הדגימות על ידי דגירה עליהן עם חיץ הגברה למשך 30 דקות ב- RT.
2. הכינו כל סיכת ראש על ידי קירור מהיר של הנפחים הרצויים בצינורות נפרדים.
   1. כדי להכין 500 μL של תמיסת הגברה, השתמש 30 pmol של כל סיכת ראש (למשל, עבור 500 μL, השתמש 10 μL של 3 μM תמיסת סיכת שיער סטוק).
   2. העבירו את תמיסת סיכת הראש לצינורות.
   3. לדגור ב 95 ° C במשך 90 שניות.
   4. מצננים ל-RT למשך 30 דקות בחושך.
3. הכן את תמיסת סיכת הראש על ידי הוספת כל סיכות השיער המקוררות בהצמדה למאגר הגברה של 500 μL ב- RT.
4. הסירו את תמיסת ההגברה מראש והוסיפו את תמיסת סיכת הראש המלאה.
5. לדגור על הדגימות במשך הלילה (12-18 שעות) ב- RT בחושך.
6. הסירו סיכות שיער עודפות על ידי שטיפה עם 5x SSCT ב-RT באופן הבא: 2 x 5 דקות, 2 x 15 דקות ו-1 x 5 דקות.
7. החלף את תמיסת 5x SSCT ב- PBS 1x, ואחסן ב- 4 ° C למשך לא יותר מ 2-3 ימים, או המשך ישירות לצביעה גרעינית.
   הערה: במידת הצורך, השתמש בדגימות RNA-FISH בבדיקת immunofluorescence סטנדרטית, ואחריה צביעה גרעינית (ראה סעיף 3).

5. צביעה גרעינית והרכבה על שקופיות

1. שאפו את פתרון 1x PBS, והחלף אותו בתמיסת DAPI (0.2 מיקרוגרם/מ"ל) ב-1x PBS.
2. דגרו על הדגימות במשך 10 דקות ב- RT בחושך.
3. שאפו את תמיסת DAPI, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS 1x.
4. מניחים את הממברנה החתוכה מהחדרות Transwell על 10 μL של אמצעי הרכבה נגד דהייה כאשר התאים פונים כלפי מעלה, ומוסיפים אמצעי הרכבה נוסף (5 μL) לממברנה.
5. מכסים את הקרומים בכיסויים.
6. רפא את הדגימות המותקנות על משטח יבש ושטוח בחושך.
7. לאחר הריפוי, אטמו את שולי הכיסויים עם חומר איטום VALAP או לק כדי למנוע מהדגימות להתייבש.

3. ניתוח אימונופלואורסנציה של תאי Vero ותרביות HAE

הערה: בצע את בדיקת האימונופלואורסנציה ביום 3 עבור קווי תאים או ביום 4 עבור תרביות HAE. השתמש בגישה שונה עבור כל דגם. כל ההבדלים מצוינים בבירור.

1. שאפו את פתרון PBS 1x מהבארות.
2. חסום את הדגימות על ידי דגירה עם אלבומין בסרום בקר 1% w / v בתמיסת PBST למשך 30 דקות ב 37 ° C.
3. הכנת נוגדנים ראשוניים על ידי הכנת דילולים מתאימים בתמיסת חסימה, ודגירה.
   1. עבור תאי Vero על גבי כיסויים:
      1. יש להניח טיפות (30-50 μL) של תמיסת נוגדנים על פרפילם בתא לחות.
      2. הניחו את הכיסויים על טיפות הנוגדנים כשהתאים פונים כלפי מטה.
   2. עבור HAE, החלף את החומר החוסם בתוספות בתמיסת נוגדנים (100 μL), ודגר על הדגימות בתא לח.
      הערה: התאם את הזמן והטמפרטורה עבור כל דגירה עם הנוגדן הראשי. פרמטרים אופייניים הם 2 שעות ב RT או לילה ב 4 °C (75 °F).
4. שטפו את הדגימות במשך 3 x 5 דקות עם PBST.
   1. עבור תאים על כיסויים, להעביר לצלחת 12 בארות ולהוסיף תמיסת PBST.
   2. עבור תרביות HAE, החלף את תמיסת הנוגדנים בתמיסת PBST.
5. בדוק את מקורות האור והמסננים הזמינים עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי.
6. בחר נוגדנים משניים בהתאם למין המארח. בחר את הפרמטרים הפלואורופורים (אורכי גל עירור ופליטה, רוחב ספקטרום ויעילות עירור בהתאם למקור האור הזמין).
   הערה: ניתן למדל פרמטרים ספקטרליים באמצעות כלים מקוונים (ראה טבלת חומרים).
7. הכינו פתרונות נוגדנים משניים מתאימים על ידי דילולם בתמיסת חסימה.
8. לדגור עם נוגדנים משניים (כמו 6.3), אבל לדגור במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
9. שטפו את הדגימות כמו בשלב 3.4.
10. צביעה גרעינית והרכבה על שקופיות
    1. עבור תאים על כיסויים
       1. שאפו את ה-PBST, והחליפו אותו ב-DAPI (0.2 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת PBS אחת.
       2. דגרו על הדגימות במשך 10 דקות ב- RT בחושך.
       3. שאפו את תמיסת DAPI, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS 1x.
       4. הניחו את הכיסויים על טיפות של 10 μL של אמצעי הרכבה כאשר התאים פונים כלפי מטה.
       5. אטמו את הכיסויים בלק.
    2. עבור תרבויות HAE
       1. שאפו את ה-1x PBST, והחליפו אותו ב-DAPI (0.2 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת PBS אחת.
       2. דגרו על הדגימות במשך 10 דקות ב- RT בחושך.
       3. שאפו את תמיסת DAPI, ושטפו את התאים פעמיים עם PBS 1x.
       4. הניחו את הממברנות החתוכות על טיפות של 10 מיקרוליטר של תווך הרכבה כשהתאים פונים כלפי מעלה, והוסיפו אמצעי הרכבה נוסף (5 μL) לממברנה.
       5. מכסים את הקרומים בכיסויים.
       6. אטמו את הכיסויים בלק.

4. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. הגדר את הרצועות על-ידי ציון הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש.
2. בחר את מצב הסריקה ואת המהירות.
3. התאם את ערכי העוצמה, הרווח וההיסט של הלייזר עבור כל פלואורופור על ידי השוואתם לבקרות שליליות מתאימות: עבור וירוסים, תאים נגועים מדומה; עבור חלבונים תאיים, דגימות מוכתמות בנוגדנים לבקרת איזוטיפ ממארח מתאים.
4. כדי לקבל תמונה תלת-ממדית, הפעל את מצב מחסנית z והגדר את הגבול העליון והתחתון. הגדר את גודל המדרגה/מספר.
   הערה: לפרטים נוספים על הדמיית קורונה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 880	ZEISS
אינקובטור גלקסי170R	ניו ברנזוויק	CO170R-230-1000
חומרים
15 מ"מ x 15 מ"מ מס' 1 כיסויים	LabSolute	7695022
צינורות 1.5 מ"ל	FL-מדיקל	5.350.023.053
צלחת 12 בארות	TTP	92412
Alexa fluorophore 488-נוגדנים משניים מצומדים	Invitrogen
β5-טובולין	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-134234
דאפי	תרמו סיינטיפיק	D1306
מאגר הגברה HCR	מכשירים מולקולריים, Inc	BAM01522	ניתן להכין גם חיץ doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
מגבר HCR B1-h1 אלקסה פלואור 647	מכשירים מולקולריים, Inc.	S013922
מגבר HCR B1-h2 Alexa Fluor 647	מכשירים מולקולריים, Inc.	S012522
מאגר הכלאה של בדיקת HCR	מכשירים מולקולריים, Inc.	BPH03821	ניתן להכין גם חיץ doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
בדיקת HCR מוגדרת עבור SARS-CoV-2 Ncapsid	מכשירים מולקולריים, Inc.	PRE134
חיץ שטיפת בדיקה HCR	מכשירים מולקולריים, Inc.	BPW01522	ניתן להכין גם חיץ doi:10.1242/dev.165753: מידע משלים
ספקטר פלואורסצנטי			מידול פרמטרים ספקטרליים
ImageJ, פיג'י			רכישה ועיבוד של תמונות z-stack
אימונופלואורסנציה (IF)	חסימת	(1% BSA ב-PBST) 30 דקות ב-37°C
	דגירה ראשונית של נוגדנים	(תמיסת נוגדנים של ריכוז apropriate בתמיסת חסימה) 2 שעות בטמפרטורת החדר / לילה ב 4 ° C, 30-50 μL	(תמיסת נוגדנים של ריכוז apropriate בתמיסת חסימה) 2 שעות בטמפרטורת החדר / לילה ב 4 °C, 100 μL
	שטיפת נוגדנים ראשונית	(PBST) 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר
	דגירה משנית של נוגדנים	(תמיסת נוגדנים של ריכוז apropriate בתמיסת חסימה) 1 שעות ב 37 ° C, 30-50 μL	(תמיסת נוגדנים בריכוז מתאים בתמיסת חסימה) 1 שעות ב 37 ° C, 100 μL
	שטיפת נוגדנים משנית	(PBST) 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר
	צביעה גרעינית	(פתרון DAPI) 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן 2 x 5 דקות עם 1x PBS