בדיקת מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים בסרום אנושי

תקציר

מקור: Gross, F. L. et al., מדידת תגובות נוגדנים מנטרלי שפעת לנגיפי A(H3N2) בסרה אנושית על ידי בדיקות מיקרונטרול באמצעות תאי MDCK-SIAT1.J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים בדיקות מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים באמצעות תאי כליות כלבים Madin-Darby המבטאים יתר על המידה חומצה סיאלית מקושרת α2,6 בסרה. בדיקה זו משמשת לעתים קרובות עבור סרולוגיה אנושית שפעת

פרוטוקול

יש לטפל בכל נגיפי השפעת בהתאם לדרישות רמת הבטיחות הביולוגית המתאימות (BSL-2 ומעלה) כפי שהוגדרו בבטיחות ביולוגית במעבדות מיקרוביולוגיות וביו-רפואיות (BMBL).

1. הכנת ריאגנטים וחומר מוצא

1. הכינו תאי Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial transferase (MDCK-SIAT1) ומדיום תרבית תאים סטרילית
   1. הכינו את מדיום תרבית התאים MDCK-SIAT1 באמצעות 500 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, 10% v/v סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 2 mM L- גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, 1 מ"ג / מ"ל G418 סולפט (למשל, גנטיקה), ו 100 U/ml פניצילין עם 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (אופציונלי). יש לעקר באמצעות סינון דרך קרום בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר. G418 סולפט מתווסף כדי להבטיח יציבות פלסמיד בתאי MDCK-SIAT1.
   2. הכן את קו התאים MDCK-SIAT1. בצלוחיות תרבית רקמה^בגודל 162 ס"מ המכילות 30 מ"ל של תרבית תאים סטרילית, צלוחיות זרעים עם 2 - 2.5 x 10⁶ תאי MDCK-SIAT1 ודגרים ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך יומיים; זה ישמש לקביעת מינון זיהומי בתרבית רקמות (TCID) ובדיקות MN.
      הערה: תאי MDCK-SIAT1 סופקו באדיבות על ידי ד"ר מ. מטרוסוביץ', מרבורג, גרמניה. קו תאים זה ניתן להשיג גם באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו את אמצעי התפשטות הנגיף הסטריליים באמצעות 500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה, 0.3% אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 20 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה (HEPES). יש לעקר באמצעות סינון דרך קרום בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.
3. הכינו 0.75% (v/v) תאי דם אדומים של שרקנים (gpRBCs) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) המכילים 0.01 M PBS, ב-pH 7.2.
4. הכינו את מדלל הנגיף הסטרילי באמצעות גלוקוז גבוה DMEM, 1% חלק אלבומין בקר V (BSA), 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 20 mM HEPES. יש לעקר על ידי סינון עם קרום בגודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר ולהכין טרי לכל בדיקה.
5. הכינו את קיבוע התאים הקרים כאצטון קר 80% ב-PBS (0.01 M PBS, pH 7.2).
6. הכן את מאגר הכביסה באמצעות PBS (0.01 M PBS pH 7.2) ו- 0.3% (v/v) tween-20.
7. הכינו את מדלל הנוגדנים באמצעות PBS (0.01 M PBS, pH 7.2), 0.3% (v/v) tween-20 ו-5% חלב יבש ללא שומן.
8. השתמש נגד שפעת עכבר NP שיבוטים חד שבטיים שיבוטים A1 ו A3 מאגר כמו הנוגדן העיקרי. לדלל את דילול הנוגדנים בריכוז האופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטרציה.
9. השתמש ב- IgG נגד עכבר עיזים מצומד לפרוקסידז צנון סוס (HRP) כנוגדן משני. לדלל את דילול הנוגדנים בריכוז האופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטרציה.
10. הכן את מצע peroxidase באמצעות o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) ב 0.05 M פוספט ציטראט חיץ ב pH 5. יש להכין חיץ פוספט ציטראט 0.05M על ידי המסת כמוסה אחת/100 מ"ל נטול יונים, H₂O. להמיס 1 טבלית OPD (10 מ"ג)/20 מ"ל של חיץ פוספט ציטראט מיד לפני השימוש.
11. השתמש 0.5 M של חומצה גופרתית כמו פתרון לעצור OPD. הוסף 28 מ"ל של מלאי חומצה גופרתית 18 M ל 972 מ"ל של H₂O deionized במכסה מנוע כימי.
12. טיפול בסרה של בני אדם ובעלי חיים
    1. השבת בחום את הסרה האנושית המשמשת בבדיקות MN באמבט מים ב 56 ° C למשך 30 דקות לפני הבדיקה. יש להשתמש מיד או במידת הצורך, לאחסן סרה מופשרת ב 4 ° C לא יותר מ 24 שעות; אם יש צורך בתקופת אחסון ארוכה יותר, אחסנו את Sera קפוא בטמפרטורה של -20°C או קר יותר.
    2. טפל בסרה של בעלי חיים המשמשים בבדיקות MN עם אנזים הורס קולטן (RDE) וחום מושבת לפני הבדיקה כדלקמן.
       1. הפשירו את הסרה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הניחו על קרח. ערבבו נפח אחד של דגימת נסיוב בעלי חיים עם 3 כרכים של RDE. לדגור ב 37 ° C במשך 18 - 20 שעות.
       2. יש לחמם את הסרה שטופלה ב-RDE ב-56°C למשך 30 דקות. יש להוסיף 6 נפחים של PBS, pH 7.2 לכל דגימה לקבלת דילול מקדים סופי של 1:10. במידת הצורך, יש לאחסן סרה מופשרת בטמפרטורה של 4°C למשך לא יותר מ-24 שעות; אם יש צורך בתקופת אחסון ארוכה יותר, אחסנו את Sera קפוא בטמפרטורה של -20°C או קר יותר.
          הערה: סרה של בעלי חיים עשויה להכיל גליקנים שונים של חומצה סיאלית אשר עשויים להיקשר להמגלוטינין, או HAs של נגיפי שפעת ולעכב את הקישור של נוגדנים ספציפיים לשפעת נגד HA. לכן, יש צורך לטפל בכל סרה בעלי חיים לפני בדיקות MN כדי להסיר קושרי HA נגיפיים לא ספציפיים אלה בדגימות הסרום.

2. מעבר של תרבית תאים MDCK-SIAT1

הערה: כל תרביות התאים חייבות להתבצע בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום.

1. דקנט את מדיום תרבית התא מהמונושכבה התאית ב 162 ס"מ² צלוחיות. טריפסיניזציה של התאים על ידי שטיפת monolayer עם טריפסין-ethylenediamine tetraacetic חומצה (EDTA). הוסף 5 מ"ל טריפסין-EDTA כדי לכסות את monolayer התא. יש לדגור ב-37°C, 5% פחמן דו-חמצני,_CO2 עד שהחד-שכבה מתנתקת (5-10 דקות). הוסף 15 מ"ל של מצע תרבית תאים MDCK-SIAT1 לכל בקבוק המכיל תאים טריפסיניים, ופיפטה למעלה ולמטה לתאים נפרדים.
2. השתמש hemocytometer ו trypan כחול כדי לקבוע את ספירת התאים ואת הכדאיות. זרעו את התאים בצלוחיות תרבית רקמה חדשות בגודל 162^ס"מ המכילות 30 מ"ל של מדיה של תרבית תאים עם 2-2.5 x 10⁶ תאים / בקבוק ודגרו ב 37 ° C עם 5% CO₂ למשך יומיים לשימוש בבדיקות TCID ו- MN. תאי זרעים ב 4 - 5 x 10⁶ תאים / בקבוק לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 2 ימים לשימוש בהתפשטות וירוסים.
   הערה: ניתן להתאים את צפיפות הזריעה אם רוצים תקופות תרבית קצרות או ארוכות יותר. עבור התפשטות הנגיף, התאים צריכים להגיע למפגש של מעל 100%. עבור מבחני TCID (TCID) ו-MN של תרביות רקמה, התאים צריכים להיות במפגש של 75%-95% (איור 1).

3. התפשטות נגיפי A(H3N2) בתאי MDCK-SIAT1

הערה: נגיף A(H3N2) יכול להיות מופץ בביצי תרנגולת עוברות בנות 10 - 11 יום על פי פרוטוקול סטנדרטי, או בתרביות תאים MDCK-SIAT1. תאי MDCK-SIAT1 צריכים להגיע למפגש של מעל 100% עבור חיסון וירוסים. ניתן לחסן את מלאי זרעי הנגיף בדילולים מרובים של החיסון. ניתן להשתמש בדילולי החיסון עם HA הקציר הטוב ביותר והדבקה לבדיקות MN נוספות.

1. הסר את מדיום תרבית התא מהחד-שכבה של התא (>100% מפגש) ב-162 ס"מ² צלוחיות. לשטוף את monolayer פעמיים עם 15 מ"ל של סטרילי 0.01 M PBS, pH 7.2, ו decant.
2. יש לסמן בקבוק 1 כבקרה ולהוסיף 20 מ"ל של אמצעי התפשטות וירוסים. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C עם 5% CO₂. השאירו את הבקבוק הזה ללא מגע והשתמשו בו להשוואה לאחר היום הראשון של התפשטות הנגיף.
3. הוסף 10 מ"ל של אמצעי התפשטות וירוס סטריליים לצלוחיות ודגור על כל הצלוחיות ב 37 ° C, 5% CO₂. הפשירו בקבוקון של נגיף השפעת בטמפרטורת החדר ואז הניחו על קרח. לדלל עם אמצעי התפשטות הנגיף לדילול היעד.
   הערה: ניתן להתאים דילולי מטרה בהתבסס על טיטרים HA של מלאי וירוסים. כדי להכין חיסון מדולל בקנ"מ 1:1000, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של נגיף ל-9.9 מ"ל של אמצעי התפשטות וירוס סטריליים. הפוך בעדינות, הסר 1 מ"ל של דילול 1:100 ל 9 מ"ל של מדיה סטרילית להתפשטות וירוסים והפוך בעדינות לקבלת חיסון מדולל 1:1000. מניחים על קרח.
4. הסר את כל הצלוחיות למעט בקבוק הבקרה מהאינקובטור. הסר את אמצעי התפשטות הנגיף מהצלוחיות של תאי MDCK-SIAT1 וחסן כל בקבוק ב- 10 מ"ל של וירוס מדולל. יש לדגור על הצלוחיות בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך שעה אחת, ולסובב את הצלוחיות כל 15 דקות.
5. הסר 5 מ"ל של חיסון מהצלוחיות והחלף באמצעי התפשטות וירוס 15 מ"ל המכיל 1 מיקרוגרם/מ"ל Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin (TPCK-trypsin). לדגור את הצלוחיות ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 16-18 שעות.
6. לאחר הדגירה הלילית, התבוננו בצלוחיות תחת הגדלה של מיקרוסקופ 100X וחפשו השפעות ציטופתיות (CPE) על התאים. הסר 15-17 מ"ל של supernatant וירוס מן הצלוחיות (ים), ולהחליף אותו עם 15 - 17 מ"ל של מדיה התפשטות וירוס מוכן טרי המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל TPCK-טריפסין.
7. לדגור על צלוחיות ב 37 ° C, 5% CO₂. עקוב אחר ה- CPE של החד-שכבה (בהשוואה לצלוחית הבקרה של התא) ובדוק את ה- HA מעת לעת (כל 4 שעות) עם 0.75% gpRBC עד הקציר.
   1. הגדר צלחת מיקרוטיטר HA 96-well. הוסף 50 μL של 0.01 M PBS, pH 7.2 לבארות A2 - A12 ו- B2 - B12 (כפולות), ובארות H1 - H12 לשליטה.
   2. הוסף 100 μL של סופרנאטנט וירוס ל- A1 ו- A2, ובצע דילול סדרתי פי 2 מ- A1 ו- B1 עד A12 ו- B12. יש להשליך 50 μL לאחר ערבוב ב-A12 וב-B12. הוסף 50 μL של 0.75% gpRBCs לשורות A, B ו- H.
   3. הקש על הצלחת ודגור בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
      1. קבע HA של supernatant וירוס על ידי הטיית צלחת microtiter 96 באר בזווית 45° עד 60°.
      2. לוחות קריאה עבור hemagglutination; הדילול הגבוה ביותר של הנגיף שמשיג hemagglutination מלא נחשב לנקודת הקצה של טיטרציה HA עבור הנגיף הספציפי. רשום את הגומלין של דילול הנגיף הגבוה ביותר עם hemagglutination מלא כמו titer HA של הנגיף.
         הערה: RBCs התיישבו בשורה H (פקדים) צריך להתחיל "לרוץ" וליצור צורת דמעה קטנה עקב כוח הכבידה. המתן עד ש-RBCs בבארות בקרה יסיימו לפעול, ולאחר מכן קרא את לחצני RBC בבארות הטיטרציה של הנגיף. אלה המציגים כפתורי RBC ו "לרוץ", לא להשיג hemagglutination. אתר את הדילול הגבוה ביותר של הנגיף המעכב לחלוטין את המגלונציה כנקודת הקצה של נוגד HA של הנגיף.
8. קצרו את הנגיף כאשר ה-HA של תרבית הנגיף מגיע לרמת ה-HA של תרבית הנגיף או כאשר תרבית הנגיף מגיעה ל-HA היעד (לדוגמה, יחידת HA >16), אך לפני שחד-שכבת התא מתחילה להציג CPE משמעותי.
   1. צנטריפוגה של תרבית הנגיף ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להשליך את פסולת התא. העבירו את הסופרנאטנט המבהיר המכיל את קציר הנגיף לצינור נקי. Aliquot, supernatant המכיל את הנגיף לקציר לתוך בקבוקונים קריוגניים סטריליים חד פעמיים להקפיא מיד ב -70 ° C או קר יותר.
      הערה: מלאי הנגיף המשמש לבדיקות MN צריך להיות titer זיהומיות גבוהה וחלקיקים פגומים מינימליים. הדילול המינימלי של מלאי וירוסים להשגת 100 TCID₅₀/50 μL עבור בדיקת MN הוא 1:100.
      הערה: אין להפשיר ולהקפיא מחדש את מלאי הווירוסים המשמשים במבחני MN.

4. קביעת TCID של הנגיף

1. יום 1: טיטרציה של וירוסים
   1. הפשירו בקבוקון של הנגיף בטמפרטורת החדר והניחו אותו מיד על קרח.
   2. בדוק את הנגיף בשני דילולי התחלה שונים: ^10-2 ו ^10-3. הוסף 100 μL של וירוס ל 9.9 מ"ל של מדלל וירוס עבור דילול ^10-2. הוסף 1 מ"ל של דילול ^10-2 ל 9.0 מ"ל של דילול וירוס עבור ^10-3 דילול
   .
   3. באמצעות שתי צלחות מיקרוטיטר (צלחת 1 לדילול ^10-2 וצלחת 2 לדילול ^10-3), מוסיפים 100 מיקרוליטר של דילול וירוסים לכל הבארות למעט עמודה 1 של צלחת מיקרוטיטר 96 בארות.
   4. בצע 1/2 יומן₁₀ דילולים (^10-2, ^10-2.5, ^10-3 וכו '). הוסף 146 μL של הנגיף שמתחיל בדילול לכל הבארות בעמודה 1 והעבר 46 μL באופן סדרתי מעמודה 1 לעמודה 11 (איור 2). החליפו קצוות פיפטה בין בארות. לאחר ערבוב עמודה 11, השליכו את הקצוות עם דילול 46 μL.
   5. השתמש בעמודה 12 כבקרת התא (CC); היא מכילה רק מדלל וירוסים. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C, 5% CO_2.
2. יום 1: הכנת תאי MDCK-SIAT1
   הערה: חד-שכבה של תאים MDCK-SIAT1 צריכה להגיע למפגש של 75 - 95% עבור בדיקות TCID ו- MN. בקבוק^{אחד של 162} ס"מ 2 במפגש של 95% אמור להניב מספיק תאים כדי לזרוע ~ 4 - 5 צלחות מיקרוטיטר.
   1. לשטוף את monolayer 75 - 95% confluent עם PBS 20 מ"ל כדי להסיר את FBS בתקשורת התרבות. Trypsinize התאים כדלקמן.
      1. שטפו את השכבה החד-שכבתית עם PBS סטרילי, והוסיפו 7 מ"ל טריפסין-EDTA כדי לכסות את חד-שכבת התא. הניחו את הבקבוק שטוח ודגרו בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ עד שהחד-שכבה תתנתק (כ-5-10 דקות). הוסף 7 מ"ל של וירוס מדלל לכל בקבוק המכיל את התאים trypsinized.
   2. לשטוף את התאים עם וירוס מדלל כדי להסיר את FBS.
      1. פיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי להפריד את התאים. להעביר את התאים לצינור חרוטי 50 מ"ל; מלא את הצינור עם וירוס מדלל.
      2. צנטריפוגה ב 485 x גרם במשך 5 דקות. דקל את הנגיף מדלל, להחליף אותו עם מדלל וירוס טרי 50 מ"ל, וצנטריפוגה ב 485 x גרם במשך 5 דקות. לדלל את הנגיף ולהחליף אותו עם וירוס טרי מדלל (10 מ"ל / בקבוק) כדי להשעות מחדש את הכדורית.
   3. השתמש hemocytometer ו trypan כחול כדי לקבוע את ספירת התאים ואת הכדאיות. התאם את ריכוז התא עם הנגיף מדלל ל 1.5 x 10⁵ תאים / מ"ל.
   4. הוסיפו 100 μL של תאי MDCK-SIAT1 מדוללים לכל באר של לוחות המיקרוטיטר (1.5 x 10,⁴ תאים/באר) וכסו את הלוחות. לדגור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 18 - 20 שעות.
3. יום 2: אליסה
   1. קיבוע תאים
      1. מוציאים את המדיום מלוחות המיקרוטייטר. לשטוף כל באר עם 200 μL של PBS. מוסיפים 300 μL קר 80% אצטון לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסירו את הקיבוע והניחו לצלחות להתייבש באוויר.
   2. אליסה
      1. תוספת נוגדנים ראשונית
         הערה: נוגדן חד שבטי NP נגד שפעת צריך לשמש עודף כנוגדן העיקרי ב- ELISA. קבע את דילול הנוגדנים האופטימלי עבור כל מנה של נוגדנים ראשוניים על ידי ביצוע טיטרציות נוגדנים ב- MN. בחר את ריכוז הנוגדנים העיקרי העודף ועם יחס האות לרקע הטוב ביותר.
         1. לדלל את נוגדן חד שבטי NP נגד שפעת (נוגדן ראשוני) לריכוז המטרה בדילול הנוגדנים (למשל להוסיף 30 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני ל 30 מ"ל של דילול נוגדנים לדילול מטרה של 1:1000).
         2. יש לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם 300 מיקרוליטר של חיץ כביסה. הוסף 100 μL נוגדן ראשוני מדולל לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
      2. הוספת נוגדנים משנית
         הערה: יש להשתמש באימונוגלובולין נגד עכברים נגד עכברים, IgG מצומד לפרוקסידז צנון סוס (HRP) כנוגדן משני ב- ELISA. לקבוע את דילול הנוגדנים האופטימלי עבור כל הרבה נוגדנים משניים על ידי ביצוע טיטרציות נוגדנים. בחר את ריכוז הנוגדנים המשני בעודף ועם יחס האות לרקע הטוב ביותר.
         1. לדלל את IgG נגד עכבר עז מצומד נוגדן HRP (נוגדן משני) לריכוז המטרה בדילול הנוגדנים (למשל, להוסיף 7.5 μL של נוגדן משני ל 30 מ"ל של דילול נוגדנים עבור דילול מטרה 1:4000).
         2. שטפו את הצלחות 3 פעמים עם מאגר כביסה של 300 μL. הוסף 100 μL נוגדן משני מדולל לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
      3. חיבור מצע וקריאת לוחות
         1. שטפו את הצלחות 5 פעמים עם חיץ כביסה של 300 μL והקישו על מגבון ללא סיבים.
         2. מוסיפים 100 μL של מצע טרי לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר עד לרוויית התפתחות הצבע והצפיפות האופטית (OD) של בארות בקרת תאים <0.2.
         3. הוסף 100 μL של תמיסת עצירה לכל הבארות. קרא את OD של בארות ב 490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate.
4. חישוב TCID ₅₀
   1. חישוב חציון OD₄₉₀ של פקדי התא (עמודה 12).
   2. שקול כל בדיקה היטב עם OD₄₉₀ גדול יותר מפי שניים החציון OD₄₉₀ של בארות CC כמו "חיובי"; אחרת, זה נחשב "שלילי".
   3. חשב את TCID₅₀ של הנגיף באמצעות שיטת Reed-Muench.
      1. קבע את מספר התוצאות החיוביות והשליליות בכל דילול.
      2. חשב את "חיובי מצטבר", "שלילי מצטבר", "יחס" ו"% חיובי" כפי שמודגם בטבלה 1.
      3. חשב את "המרחק הפרופורציונלי" בין הדילול המציג >50% חיוביים לבין הדילול המציג <50% חיוביים באמצעות הדברים הבאים:
         
         הערה: מקדם התיקון לדילול יומן 1/2 הוא 0.5. לדוגמה, בטבלה 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. חשב את הנגיף TCID₅₀ על ידי הוספת המרחק היחסי לדילול המציג > 50% חיובי.
         הערה: לדוגמה, בטבלה 2, TCID₅₀ הוא 10-5^+(-0.25) = 10-5.25. הערה: זהו TCID₅₀ של הנגיף לכל 100 μL (או ^10-5.25/100 μL).
   4. חשב את דילול הנגיף. עבור בדיקות MN, לדלל את הנגיף ל 200 TCID₅₀/100 μL (שווה ערך ל 100 TCID₅₀/50 μL לכל באר).
      הערה: בדוגמה בטבלה 1, 1 TCID₅₀ הוא ^{10-5.25 ב-} 100 μL, והדילול להשגת 200 TCID₅₀/100 μL הוא 1:891 בהתבסס על החישובים: 200 x 10-5.25 = ^10-2.95 = 1/10^2.95 = 1/891

5. בדיקת MN באמצעות תאי MDCK-SIAT1

1. יום 1: בדיקה ובקרה של הכנת סרה ופריסת צלחת
   1. הפשירו את הסרה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והסירו מיד לאחר ההפשרה. Aliquot כמות sera כי צריך להיבדק; יש צורך במינימום של 10 μL של סרה מקורית כדי לבדוק עם וירוס אחד בסינגלט. בדוק sera בכפילויות במידת האפשר.
   2. יש לחמם את הסרה האנושית למשך 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 56°C כמו בשלב 1.12.1. מניחים סרה על קרח לאחר השבתת חום, ומוסיפים את מדלל הנגיף לסרה כדי להשיג דילול מקדים ביחס של 1:10.
   3. RDE לטפל ולדלל מראש סרה בעלי חיים עד 1:10 לשימוש לבקרות לכל 1.12.2.
      הערה: ניתן לאחסן סרה מופשרת ומטופלת של בני אדם ובעלי חיים בטמפרטורה של 4°C למשך לא יותר מ-24 שעות. יש לאחסן את Sera בהקפאה בטמפרטורה של -20°C או קר יותר אם נדרשת תקופת אחסון ארוכה יותר לפני הבדיקה.
   4. כדי לבדוק עם וירוס אחד, הוסף סרה מדוללת 100 μL 1:10 לעמודות A1 עד A10 (איור 3). הוסף 50 μL של וירוס מדלל לשורות B עד H, למעט עמודות 11 ו- 12 (איור 3). בצע דילול טורי פי 2 משורות A עד H, והשלך את 50 μL האחרונים בשורה H (איור 3).
      הערה: כאשר יש לבדוק מספר וירוסים, ניתן לדלל סרה בצינורות טיטרים. דילול הסרום, כדי לקבוע את טיטר הסרום, בבאר A הוא 1:10, באר B 1:20, באר C 1:40, באר D 1:80, באר E 1:160, באר F 1:320, באר G 1:640, באר H 1:1,280 (איור 3).
   5. לבקרת וירוסים, הוסף 50 μL של מדלל וירוס לבארות A12, B12, C12 ו- D12 (ללא סרה). לבקרת התא, הוסף 100 μL של מדלל וירוס לבארות E12, F12, G12 ו- H12 (ללא וירוס, ללא סרה).
   6. עבור סרת הבקרה (לדוגמה, פקדי Ferret Sera), הוסף 100 μL של סרה בקרה מדוללת לבאר A עמודה 11 והוסף 50 μL של וירוס מדלל בארות B11 - H11. דילול סדרתי כלפי מטה.
   7. מכסים את הצלחות, ודגרים ב 37 ° C, 5% CO₂ עד מוכן לתוספת הנגיף.
2. יום 1: תוספת וירוסים
   1. לדלל את הנגיף ל 100 TCID₅₀/50 μL עם וירוס מדלל.
   2. הוסף וירוס מדולל של 50 μL לכל הבארות, למעט עמודה 11 בלוחות הטיטרציה האחורית (BT) ובארות בקרת התאים E12, F12, G12 ו-H12 בכל הלוחות (איור 3). עבור לוחות אלה עם סרה בקרה בעמודה 11, הוסף את הווירוס לעמודה 11.
   3. טיטרציה אחורית (BT)
      1. כלול BT בעמודה 11 של קבוצה אחת של לוחות כפולים (לדוגמה, לוחות 1A ו- 1B). הוסף 50 μL של וירוס מדלל לכל הבארות בעמודה 11. הוסף 50 μL של הנגיף ב 100 TCID₅₀/50 μL לבאר הראשונה (A11). מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה.
      2. מערבבים ומעבירים 50 μL לבארות עוקבות כדי לבצע דילולים טוריים פי 2. החליפו את קצות הפיפטה בין בארות כדי למנוע סחבת וירוסים. יש להשליך 50 μL מבאר H11.
      3. הוסף 50 μL של וירוס מדלל לעמודה 11 כדי להביא את הנפח הסופי ל 100 μL. הקש על הצלחות כדי לערבב.
   4. צלחות דגירה ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 1 שעות.
   5. בצע חיבור תאי MDCK-SIAT1 ביום הראשון ו-ELISA ביום השני כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.3 (המתוארים גם בשלבים 5.3 ו-5.4)
3. יום 1: חיבור תאי MDCK-SIAT1
   1. הכן את תאי MDCK-SIAT1 כמתואר בשלב 4.2. הוסף 100 μL MDCK-SIAT1 תאים ב 1.5 x 10⁵ תאים / מ"ל לכל באר (1.5 x 10⁴ תאים / באר). לדגור את הצלחות ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 18 - 20 שעות.
4. יום 2: אליסה
   1. לאחר דגירה של לילה, ביום השני, לתקן את התאים עם 80% אצטון קר כמתואר בשלב 4.3.
   2. הוספת נוגדנים ראשונית
      1. שטפו את הצלחות 3 פעמים עם מאגר כביסה של 300 μL. לדלל את נוגדן חד שבטי NP נגד שפעת (נוגדן ראשוני) לריכוז האופטימלי כפי שנקבע על ידי טיטרציה בדילול נוגדנים (למשל להוסיף 30 μL של נוגדן ראשוני ל 30 מ"ל של דילול נוגדנים לדילול מטרה של 1:1000).
         הערה: 100 μL של נוגדן ראשוני נדרש לכל באר. ~ 10 מ"ל נדרש לכל צלחת.
      2. הוסף 100 μL נוגדן ראשוני מדולל לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   3. הוספת נוגדנים משנית
      1. יש לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם חיץ כביסה של 300 μL. לדלל את IgG נגד עכבר עז מצומד נוגדן HRP (נוגדן משני) לריכוז היעד בדילול נוגדנים (למשל, להוסיף 7.5 μL של נוגדן משני ל 30 מ"ל של דילול נוגדנים למטרה 1:4000).
         הערה: 100 μL של נוגדן משני נדרש לכל 96 באר. ~ 10 מ"ל נדרש לכל צלחת.
      2. הוסף 100 μL נוגדן משני מדולל לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   4. חיבור מצע וקריאת לוחות
      1. שטפו את הצלחות 5 פעמים עם חיץ כביסה של 300 μL והקישו על המגבון ללא סיבים.
      2. הוסף 100 μL של מצע טרי מוכן לכל באר ודגר בטמפרטורת החדר עד שבארות בקרת הנגיף מגיעות OD₄₉₀ = 0.8 - 3, עם בקרת התא ברקע נמוך OD₄₉₀ <0.2.
      3. הוסף 100 μL של פתרון עצירה לכל הבארות. קרא את OD של בארות ב 490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate.
5. ניתוח נתונים
   הערה: חישובי MN נקבעים עבור כל צלחת בנפרד.
   1. קבע את טיטר הנוגדנים המנטרל של כל דגימת סרום.
      1. חשב את חיתוך OD₄₉₀ של 50% נטרול וירוסים עבור כל לוח באמצעות המשוואה הבאה:
         
         הערה: כאן x = 50% מחתך הנטרול. דילול הסרום ההדדי המתאים לדילול הגבוה ביותר עם OD₄₉₀ פחות מ-50% מהחתך (≥50% עיכוב) נחשב לטיטר נוגדנים מנטרל עבור דגימת הסרום (איור 4).
   2. בדוק כי בארות בקרת התא יש OD₄₉₀ <0.2 ואת בארות בקרת וירוסים יש OD₄₉₀ = 0.8 - 3.
   3. אמת את ההדבקה של הנגיף בכל בדיקה (100x TCID₅₀) על ידי וירוס BT. הטווח המקובל של BT הוא 50, 100 או 200 TCID. אם משתמשים באותו חיתוך כפי שהוגדר בשלב 4.4.2, דילול הווירוסים הגבוה ביותר בעמודה BT עם OD מעל החיתוך צריך להיות בבארות E11, F11 ו- G11.
      הערה: הבקרות החיוביות בסרום אמורות לתת טיטרים בטווח של פי 2 מהערכים שהתקבלו בבדיקות הקודמות. OD₄₉₀ של בקרת הסרום השלילית צריך להיות דומה לזה שנצפה עבור בקרת הנגיף.

תוצאות

איור 1. תרבית תאים MDCK-SIAT1.תאי MDCK-SIAT1. (A) MDCK-SIAT1 confluent monolayer (>100% confluency) לחיסון וירוסים; (B) תאי MDCK-SIAT1 בשלב יומן עם מפגש של 75 - 95% עבור מבחני TCID₅₀ ו- MN.

איור 2. פריסת צלחת TCID...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם גלוקוז גבוה	מדעי החיים	11965	מרכיב קריטי בתרבית תאים סטרילית, התפשטות וירוסים ומדיה מדללת וירוסים
סרום בקר עוברי (FBS)	היקלון	SH30070.03
אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V, ללא פרוטאז	סיגמא-אולדריץ'	3117332001
ל-גלוטמין	מדעי החיים	25030-081
נתרן פירובט	מדעי החיים	11360-070
גנטיצין G-418 מלח דיסולפט	סיגמא-אולדריץ'	A1720-5G
HEPES	מדעי החיים	15630-080
פניצילין/סטרפטומיצין	מדעי החיים	15140-122
אצטון	VWR	67-64-1	משמש בריכוז של 80%
מאגר פוספט-ציטראט עם נתרן פרבוראט	סיגמא-אולדריץ'	SLBF2806V
O-פנילאנדיאמין Dihydrochloride טבליה	סיגמא-אולדריץ'	SLBQ1086V	טבליה אחת לכל 100 מ"ל מים באיכות תרבית תאים
חומצה גופרתית	פישר סיינטיפיק	A510-P500	משומש ריכוז סופי 0.5M
אתנול, דנטורציה, 4 ליטר	VWR	EM-AX0422-3	משמש בריכוז של 70%
טריפסין-EDTA	מדעי החיים	1748048
RDE II "Seiken"	דנקה סייקן	370013
טווין 20	סיגמא-אולדריץ'	P1379-500 מ"ל
Ab חד-שבטי עכבר אנטי-NP	בריכת Millipore	MAB 8257 MAB 8258
HRP מסוג IgG נגד עכבר	KPL	074-1802
צלחות שטוחות 96 בארות	תרמו סיינטיפיק	3455
קורא צלחות	מכשיר מולקולרי	ספקטרומקס 384 פלוס
בקבוק תרבית תאים 162 סמ"ר/מכסה אוורור	קורנינג/VWR	3151