בדיקה לגילוי פרץ חמצוני בדיסקיות עלי ארבידופסיס בעת האצה חיסונית

תקציר

מקור: Bredow, M., et al. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת התפרצות חמצונית בעלי ארבידופסיס לאחר חיסול מערכת החיסון. דיסקיות עלים, חתוכות מעלי צמחים, מודגרות בפפטידים חיידקיים המתפקדים כתבניות מולקולריות הקשורות לחיידקים או MAMPs. עם גילוי MAMPs, תאים צמחיים לגרום לייצור של ROS חוץ-תאי, אשר מזוהה באמצעות מבחן chemiluminescence.

פרוטוקול

1. גילוי פרץ ROS בדיסקיות עלי ארבידופסיס בעקבות אליציטוט חיסוני

1. גידול צמחים ותחזוקתם.
   1. כדי לסנכרן נביטה, ריבוד זרעי Arabidopsis על ידי השעיית כ 50 זרעים ב 1 מ"ל של 0.1% אגר סטרילי [w / v] ולאחסן ב 4 ° C (ללא אור) במשך 3-4 ימים.
      הערה: ריבוד בקרת רקע מסוג פרא (לדוגמה, Col-0) וגנוטיפים עם תפוקות חיסוניות גבוהות ונמוכות (לדוגמה, cpk28-1 ו- bak1-5, בהתאמה) שישמשו כבקרות פנימיות.
   2. לזרוע זרעים על הקרקע ולנבוט בתנאים סטנדרטיים של יום קצר (22 ° C, 10 שעות אור, 150 μE / m² / s עוצמת אור, ו 65-70% לחות יחסית).
   3. לאחר כ-7 ימים, השתמשו במלקחיים להשתלת שתילים בודדים בעציצים חדשים, מופרדים ב-4 ס"מ לפחות כדי לאפשר התפתחות מלאה של רוזטה. להשתיל 6-12 שתילים לכל גנוטיפ ולחזור לתנאים סטנדרטיים של יום קצר. באופן קבוע להשקות ולהפרות צמחים (1 גרם / ליטר של 20-20-20 דשן כל שבועיים).
2. אספו דיסקיות עלים בצלחות של 96 בארות להתאוששות לילה.
   1. 4-5 שבועות לאחר הנביטה (איור 1A), השתמשו בניקוב ביופסיה חד בקוטר 4 מ"מ כדי להסיר דיסק עלה אחד לכל צמח, תוך הימנעות מאמצע הווריד וזהירות להגביל את הפציעה (איור 1B). הניחו את דיסקיות העלים בלוח לומנומטר בן 96 בארות שאינו בשימוש המכיל 100 μL של מים מזוקקים פעמיים (ddH₂O) כאשר הצד האדקסיאלי פונה כלפי מעלה כדי למנוע התייבשות (איור 1C). אם אתה מעריך מספר עורכי דין, הסר דיסק עלה אחד מאותו עלה עבור כל טיפול מעורר.
      הערה: עלי דגימה מורחבים במלואם, שלישי עד חמישי מראש הרוזטה, ובערך באותו גודל וגיל כדי להגביל את השונות. במידת האפשר, חתכו את דיסקיות העלים לשניים באמצעות סכין גילוח לפני התאוששות הלילה, מכיוון שהדבר מגדיל את שטח הפנים החשוף לתמיסת ההשראה.
   2. יש להתאושש למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי למנוע הפרעה של ROS הנוצרת על ידי פציעה במהלך איסוף דיסק עלים. כסו את הצלחות במכסה כדי למנוע אידוי.
3. בצע את הטיפול מעורר ולמדוד את ייצור ROS.
   1. תכנת את קורא הלוחות לפני הוספת תמיסת התגובה, מכיוון שפעולה זו תקצר את הזמן בין התחלת פרץ ROS לבין המדידות הראשונות שתועדו. השתמש בתוכנה מסחרית המתאימה לקורא הלוחות. במקרה שלנו (ראה תוכן עניינים), לחץ על הגדרות ובחר את מחסנית LUM96 ואת סוג הקריאה הקינטית. לחץ על הקטגוריה אזור קריאה וגרור לבחירת תת-ערכה של בארות או את כל הלוח לקריאה. תחת הכרטיסיה PMT ואופטיקה, הגדר את זמן השילוב ל- 1,000 אלפיות השנייה. תחת הכרטיסיה תזמון, הגדר את זמן הפעולה הכולל ל- 40-60 דקות ואת המרווח ל- 2 דקות.
   2. מוציאים מים מכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.
      הערה: אין לנקב דיסקיות עלים, מכיוון שהדבר עלול לגרום ללחץ פצוע ולגרום לתפוקות ROS משתנות יותר.
   3. הכינו תמיסת תגובה המכילה 100 מיקרומטר לומינול, 10 מיקרוגרם/מ"ל חזרת פרוקסידאז (HRP), ואת הריכוז הרצוי של מעורר (לדוגמה: elf18 ב-1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר או 1,000 ננומטר) ב-ddH₂O סטרילי באמצעות תמיסה של 10 מ"ל עבור צלחת אחת בת 96 בארות.
      הערה: להמיס פפטידים lyophilized בסטרילי H₂O בצינורות קישור נמוך כדי ליצור מלאי 10 mM, להקפיא הבזק בנוזל N₂, ולאחסן ב -80 ° C. כאשר הוא מוכן לשימוש, יש לדלל את המלאי ב-H₂O סטרילי כדי ליצור מלאי עבודה של 100 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
   4. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לחלק 100 μL של תערובת התגובה לכל באר, הוספת הפתרון לכל דיסקיות עלה של אותו טיפול בו זמנית. כלול תגובת בקרה (ללא אליציטטור) עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות ה- ROS הבסיסיות בהיעדר אליציטוט. מדוד באופן מיידי את פליטת האור עבור כל אורכי הגל בספקטרום הנראה באמצעות קורא microplate.
      הערה: הכן ויישם את תמיסת התגובה תחת תאורה חלשה, מכיוון שלומינול ו-HRP הם ריאגנטים רגישים לאור. יש לשמור ריאגנטים על קרח או בטמפרטורה של -20°C, אלא אם כן הם בשימוש.
   5. מדוד פליטת אור עם זמן אינטגרציה של 1,000 אלפיות השנייה במרווחים של 2 דקות על פני פרק זמן של 40-60 דקות בקורא מיקרו-לוחות כדי ללכוד את פרץ החמצון הדינמי (איור 1D).
      הערה: השתמש בזמן אינטגרציה ארוך יותר כדי לשפר את רגישות המבחן, תוך הבטחה שניתן למדוד את כל הדגימות בלוח של 96 בארות במרווח זמן אחד.

תוצאות

איור 1. בדיקת פרץ חמצוני מבוסס לומינול בעקבות השראת חיסון בארבידופסיס. (A) לגדל צמחים על הקרקע בתנאים קצרים במשך 4-5 שבועות. (B) השתמשו בניקוב ביופסיה בקוטר 4 מ"מ כדי לאסוף דיסקיות עלים מכל צמח ולהתאושש במהלך הלילה ב-ddH2O. (C) הוסף תמיסת תגובה (100 מיקרומטר לומינול, HRP של 10 מיקרוגרם/מ"ל והריכוז הרצוי של אליצטור) ומדוד פליטת אור במשך 40-60 דקות, במרווחים של 2 דקות עם זמן אינטגרציה של 1,000...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
20-20-20 דשן	צמח Prod	10529	יש לערבב 1 גרם/ליטר במים ולמרוח על צמחים כל שבועיים לצמיחה מיטבית.
ניקוב ביופסיה 4 מ"מ	מדיקל מארט	232-33-34-P	ניתן להשתמש גם במשעמם שעם עם שטח פנים של 0.125 ס"מ^2.
BioHit mLine מכני 12 פיפטה רב ערוצית (30-300 uL)	סרטוריוס	725240	ניתן להשתמש בכל פיפטה רב ערוצית, כמו גם בפיטר יחיד במידת הצורך.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	אחסנו פפטיד במלאי של 10 mM בטמפרטורה של -80C בצינורות בעלי קישור חלבון נמוך. לאחר ההפשרה, אחסנו מלאי עבודה של 100 uM בטמפרטורה של -20C.
מלקחיים	פישר סיינטיפיק	22-327379
חזרת פרוקסידאז	סיגמא-אולדריץ'	P6782	יש להתמוסס במים טהורים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20C והרחק מאור.
לומינול	סיגמא-אולדריץ'	A8511	להתמוסס ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20C והרחק מאור.
מלחי בסיס מוריסאז' וסקופג	מעבדות סידרלן	MSP09-100LT	יש לאחסן ב-4C.
אדמה	גננות SunGrow	סאנשיין מיקס #1	סוגי קרקע אחרים יכולים לשמש גם לגידול Arabidopsis. מערבבים עם מים בעת מילוי סירים.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader עם מודול LUM	התקנים מולקולריים		כל קורא לוחות המסוגל לזהות זוהר יכול לשמש עבור בדיקות אלה.
צלחות פוליסטירן לבן 96 בארות	פישר סיינטיפיק	07-200-589