מדידת עיכוב של צמיחת שתילים על ידי מערכת החיסון

תקציר

מקור: Bredow, M. et al., Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

סרטון זה מדגים את בדיקת עיכוב צמיחת השתיל בצמח Arabidopsis thaliana . ההשפעה של ריכוז מוגבר של פפטיד חיסוני מעורר על צמיחת שתילים נקבעת.

פרוטוקול

1. בדיקת עיכוב גידול שתילים

1. מעקרים זרעים וזורעים על צלחות Murashige ו-Skoog (MS).
   1. הכינו מדיום סטרילי בחצי חוזק (0.5x) MS בינוני (2.16 גרם/ליטר) המכיל 0.8% אגר [w/v]. יוצקים מדיה לתוך צלחות (90 x 15 מ"מ) במכסה מנוע זרימה למינרית.
   2. לעקר כ -100 זרעים בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של אתנול 70% במשך 2 דקות ולהסיר על ידי שאיפה. מוסיפים 1 מ"ל של 40% אקונומיקה ורוקדים בעדינות במשך 17 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים אקונומיקה בשאיפה ושוטפים שלוש פעמים ב-1 מ"ל מים סטריליים למשך 5 דקות. השעיה ב 1 מ"ל של סטרילי 0.1% agar.
      הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול עיקור זרעי גז כלור24.
   3. זרעו כ-100 זרעים לגנוטיפ על צלחות אגר MS באמצעות פיפטה ואטמו עם סרט מיקרו-נקבוביות במכסה מנוע זרימה למינרית.
      הערה: הימנע הנחת זרעים בקרבת מקום כמו זה יקשה על שתילת שתילים מאוחר יותר.
   4. ריבוד זרעים על-ידי הנחת צלחות בטמפרטורה של 4°C (ללא אור) למשך 3-4 ימים כדי לסנכרן את הנביטה (איור 1A).
2. השתלת שתילים בצלחות בנות 48 בארות המכילות פפטידים מעוררי חיסון.
   1. לאחר הריבוד, יש להעביר את הלוחות לאור בתנאים קצרים של יום (22°C, 10 שעות אור, 150 μE/m²/s עוצמת אור ו-65-70% לחות יחסית) למשך 3-4 ימים כדי לאפשר נביטה.
   2. במכסה מנוע של זרימה למינרית, הכינו דילול פפטידי מעורר (0 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר ו-1,000 ננומטר) במדיה נוזלית סטרילית של 0.5x MS המכילה 1% סוכרוז [w/v], תוך שימוש ב-25 מ"ל טרשת נפוצה לכל צלחת בת 48 בארות. הכינו צלחות על ידי פיפטציה של 500 מיקרוליטר של מדיום נוזלי MS או מדיום MS המכיל פפטידים לכל באר. אם זמין, השתמש בפיפטור חוזר להכנת צלחת כדי לזרז את התהליך.
      הערה: עבור כל גנוטיפ, לגדל שתילים בטרשת נפוצה מבלי להסביר הבדלים מובנים בצמיחת שתילים.
   3. בעזרת מלקחיים סטריליים שותלים בזהירות שתיל אחד לכל באר באותו גודל וגיל, ומוודאים שאין נזק לשתיל או שבירה לשורש ושהשורש שקוע במדיה. עבור כל גנוטיפ, השתילו לפחות 6-8 שתילים בכל דילול פפטידי (איור 1B).
      הערה: השתלת שתילים 4 ימים לאחר הנביטה, שכן שורשים קצרים קלים יותר למניפולציה, ושתילים ישנים עשויים להניב תוצאות פחות אופטימליות.
   4. אטמו את הלוחות בסרט מיקרו-נקבוביות וחזרו לאור בתנאים סטנדרטיים של יום קצר (22°C, 10 שעות אור, עוצמת אור של 150 μE/m²/s ולחות יחסית של 65-70%). אפשר שתילים לגדול במשך 8-12 ימים.

2. קבע עיכוב צמיחה באחוזים.

1. בזהירות להסיר שתילים מ 48 צלחות באר ולייבש אותם על ידי טבילה אותם על מגבת נייר. שוקלים שתילים בקנה מידה אנליטי ורושמים ערכים. אם זמין, השתמש בקנה מידה אנליטי המצויד בפלט USB כדי לרשום ערכי משקל טריים בגיליון אלקטרוני. לפני שקילת שתילים, צלמו תמונה כדי להציג באופן חזותי עיכוב גדילה (איור 1C).
2. קבע אחוז עיכוב גדילה של שתילים שטופלו ב- elicitor בהשוואה לשתילים שגדלו בטרשת נפוצה רק כדלקמן:
   
3. התווה נתונים באמצעות גרף עמודות עם קווי שגיאה סטנדרטיים או באמצעות תרשים קופסה ושפם כדי להציג טוב יותר שונות בין ניסויים.

תוצאות

איור 1. בדיקת עיכוב גדילה של שתיל המושרה על ידי אליסיטור בארבידופסיס. (A) לזרוע שתילים על אגר MS ולגדל במשך 3-4 ימים בתנאים סטנדרטיים של יום קצר. (B) שתילי השתלה ללוחות 48 בארות המכילים MS בינוני או MS המכילים ריכוזים שונים של elf18. (C) לאחר 8-12 ימים, הערך חזותית את גודל השתיל ולאחר מכן מדוד משקל טרי באמצעות סולם אנליטי כדי לקבוע עיכוב גדילה באחוזים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
8-צלחות סטריליות היטב עם מכסה	סיגמא-אולדריץ'	CLS3548
סולם אנליטי עם טיוטת שיד	VWR	VWR-225AC	כל קנה מידה אנליטי סטנדרטי יכול לשמש למבחני איניבציה של צמיחה, עם זאת, פלט מחשב ישיר הוא אופטימלי.
BioHit mLine פיפטה מכנית 12 רב ערוצית (30-300 uL	סרטוריוס	725240	ניתן להשתמש בכל פיפטה רב ערוצית, כמו גם בפיטר יחיד במידת הצורך.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	אחסנו פפטיד מלאי של 10 mM בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בצינורות בעלי קשירת חלבון נמוכה. בעת ההפשרה, יש לאחסן מלאי עבודה של 100 uM בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלחי בסיס מוריסאז' וסקופג	מעבדות סידרלן	MSP09-100LT	יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
צלחות פוליסטירן לבן 96 בארות	פישר סיינטיפיק	07-200-589