בדיקה לאיתור ייצור מיני חמצן תגובתי ברקמת אורז עם התעוררות חיסונית

תקציר

מקור: Wang, Y., et al. זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים בדיקה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) ברקמות אורז לאחר אליציטוט תבנית מולקולרית קשורה לפתוגנים (PAMP). מקטעי נדן חתוכים ודיסקי עלים נחשפים לפפטיד שמקורו בשוטונים חיידקיים המתפקד כ-PAMP. עם זיהוי הפפטיד באמצעות קולטני זיהוי תבניות (PRR) על תאי הצמח, מתרחש ייצור מהיר וחולף של ROS, אשר מזוהה באמצעות בדיקת כימילומינסנציה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול חל על רקמות צמחים שונות. נדן אורז ודיסקיות עלים שימשו בפרוטוקול זה לזיהוי ROS עם אליציטוט PAMP. מכיוון שהבדלים נובעים בעיקר משיטת הדגימה, רק ההליכים הנפוצים מתוארים להלן, כאשר שלבים ספציפיים מוזכרים במידת הצורך.

1. הכנת רקמות וטיפול מקדים

1. נדן אורז
   1. חתכו את הנדן משתילי אורז בני 10 ימים למקטעים של 3 מ"מ עם סכין גילוח חד או להב כירורגי לטיפול מקדים יום אחד לפני בדיקת ROS (איור 1B).
   2. הניחו חמישה מקטעי נדן בבאר נפרדת של צלחת מיקרוטיטר בת 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול (ddH₂O) למשך 10-12 שעות, בחושך בטמפרטורה של 25°C, מה שמאפשר לדליפת יונים הקשורה לפציעה ולתגובות ההגנה לשכך (איור 2).
      הערה: הקפדה על החתכים אנכיים כדי להבטיח שטח חיתוך עקבי החשוף לפתרון האליציטוט היא צעד חשוב להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. הזיזו את המקטעים בעדינות. אל תבצע חתכים או פצעים נוספים במקטעים, שעלולים להוות מקור לשונות נתונים. כעיקרון, כל בדיקה חייבת להכיל לפחות חמישה עותקים משוכפלים מכיוון שהשונות של ערך ה- ROS גדולה. ככל שקיימים יותר עותקים משוכפלים, כך הנתונים אמינים יותר.
2. דיסק עלה
   1. חותכים את דיסקיות העלים (בקוטר 4 מ"מ) מצמחי אורז בני 4-6 שבועות באמצעות ניקוב ביופסיה עם בוכנה. חתכו תמיד דיסקיות עלים מהשליש האמצעי של העלה השני (ממוספר מלמעלה) של העלה הראשי כדי לצמצם את השונות בנתונים (איור 1C).
   2. הניחו דיסק עלה אחד בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות המכילה 100 μL של ddH₂O למשך 10-12 שעות לטיפול מקדים, מה שמאפשר לתגובות הקשורות לפציעה לשכוך מכיוון שהן עלולות להפריע להשראת ROS על ידי PAMPs (איור 2).
      הערה: הפעילו את דיסקיות העלים בעדינות. אין לבצע חתכים או פצעים נוספים על הדיסקים בניסוי, דבר שעלול לגרום לשינויים בנתונים. השראת ROS מתרחשת בעיקר מתאי הקצה החתוך, שכן פני השטח של רקמות האורז (עלים או נדן) מכוסים בשכבות הידרופוביות. רק התאים של הקצוות החתוכים נמצאים במגע עם פתרון האליציטוט (עיין בסעיף הדיון).
   3. שמור את כל דיסקות העלים צפות, כאשר פני השטח האבקסיאליים פונים כלפי מעלה, בבארות של צלחת מיקרוטיטר לטיפול מקדים במים כדי למנוע שינויים הקשורים לצד העלים.

2. הכנת פתרון האליציטוט

1. יש להמיס אבקת L-012 בתמיסה מימית של 20 מילימטר (6.23 מ"ג/מ"ל) עם ddH₂O ליצירת תמיסת המלאי. לאחר מכן, דלל את תמיסת המלאי עם חיץ 50 mM Tris HCl (pH 7.5) כדי להפוך את פתרון העבודה בריכוז הסופי של 500 μM L-012. שמור את תמיסת המלאי קפואה ומדוללת לתמיסת העבודה לפני השימוש.
2. הכינו את תמיסת האליציטוט המכילה PAMP, L-012 ופרוקסידז חזרת (HRP; 10 מ"ג/מ"ל ב-ddH₂O). לקבלת תמיסת אליסיטציה של 10 מ"ל, יש לערבב 9.4 מ"ל של תמיסת Tris HCl (pH 7.5) של 50 mM, 400 μL של תמיסת L-012, 100 μL של HRP ו-100 μL של flg22 (PAMP; 10 mM ב-ddH₂O). עבור הבקרה השלילית, הוסף 100 μL של ddH₂O במקום PAMP.
   הערה: שמור את תמיסות האליציטוט המוכנות בטמפרטורת החדר כדי למנוע לחץ קר על רקמות האורז. PAMPs אחרים יכולים לשמש גם לטיפול לפי הצורך, כגון כיטין (20 ng / mL בריכוז הסופי). מכיוון ש- L-012 רגיש לאור, כסה את כל הצינורות המכילים תמיסת L-012 ברדיד אלומיניום.

3. הפעלת התוכנה והגדרת הפרוטוקול עם קורא המיקרו-צלחות (ראה טבלת חומרים)

הערה: לוקח קצת זמן להגדיר את הפרמטרים של תוכנת קורא microplate. מומלץ להכין את המכונה והפרוטוקול (קליק אחד כדי להמשיך) לפני הוספת פתרון האליציטוט.

1. הפעל את התוכנה. לחץ על הלחצן ניסויים כדי ליצור פרוטוקול חדש או להשתמש בפרוטוקול קיים.
2. לחץ על Procedure בחלון המוקפץ כדי להגדיר את הצלחת. בחר את הבארות מהצלחת שיש לנטר.
3. לחץ על Start Kinetic כדי להגדיר את זמן הריצה הכולל ואת מרווח הזמן לקריאה. הגדר את זמן ההפעלה ל- 35 דקות או יותר, בהתאם לדרישות הניסוי. כדי להשיג קריאות בתדירות גבוהה ככל האפשר, בחר מרווח זמן מינימלי. עבור זמן השילוב, בחר 1 s או יותר, בהתאם לעוצמת האות.
   הערה: מרווח הזמן לקריאה תלוי במספר הדגימות ובמשך שילוב האותות.
4. לחץ על אמת | אישור כדי לאשר את ההגדרות.
5. לחץ על זהה את הצלחת החדשה בחלון המוקפץ והמתן עד שהתוכנה תבקש את תיבת הדו-שיח של צלחת הטעינה. הניחו את הצלחת לבדיקה על המנשא.
6. עצרו כאן כדי להמתין להקמת מערכת האליציטוט (בסעיף הבא). ברגע שמערכת האליציטוט מוכנה, לחץ על הפעל כדי להתחיל בקריאה.

4. הקמת מערכת אליציטוט ומדידת ייצור ROS בזמן אמת

1. בזהירות להסיר את ddH₂O מן הבארות המכילות את הרקמות שטופלו מראש, הימנעות כל נזק רקמות או התייבשות.
2. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 200 μL של פתרון elicitation לבארות המכילות את הרקמות.
3. נערו בעדינות כדי לערבב. לחץ על הפעל כדי להתחיל בזיהוי.
   הערה: עם טיפול PAMP, רקמות הצמח מגיבות ומייצרות ROS מהר מאוד. לכן, מוצע לטפל תחילה בבקרה השלילית ללא PAMP כדי להפחית את זמן הניתוח כאשר ישנם מספר טיפולים. לפעול במהירות האפשרית כדי להפחית את עיכוב האליסיטציה בין הטיפולים. ככל שהזמן בין הוספת פתרון האליציטוט לתחילת הגילוי קצר יותר, כך לכידת נתוני ניסוי חשובים תהיה טובה יותר.

תוצאות

איור 1: מצב הגידול והשלבים של שתילי אורז לדגימת נדן וחלקים מנדן האורז ועלי האורז ששימשו בבדיקה. (A) שתילי אורז הגדלים על 1/2 MS בינוני בתנאים סטריליים במשך 10 ימים ניתן לדגום עבור בדיקת ROS. זרעי אורז מעוקרים גודלו בתרבית בינונית של 1/2 MS וגודלו בפוטופריוד בהיר של 12 שעות / 12 שעות כהות בבקבוקון זכוכית שקוף, בקוטר 8.5 ס"מ ובגובה 15 ס"מ. (B) תרשים סכמטי של חלקי הדגימ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת מיקרוטיטר 96 בארות	WHB	WHB-96-01
FLG22	סנגון ביוטק	עמ' 20973	פאמפ
דור 5	ביוטק		תוכנה
L-012	פוג'יפילם	120-04891	8-אמינו-5-כלורו-7-פניל-2,3-דיהידרופירידו [3,4-ד] פירידזין-1,4-דיון, CAS #:143556-24-5
קורא Microplate	ביוטק	סינרגיה 2
פרוקסידז מחזרת (HRP)	סיגמא	עמ' 8375
סמפלר	מילטקס	15110-40
טריס	סנגון ביוטק	A610195