בדיקה לחקר פגוציטוזה מונעת קולטן Fcγ במונוציטים מונושכבות

תקציר

מקור: Tong, T. N., et al. שימוש בבדיקת מונוציטים חד-שכבתיים להערכת פגוציטוזה בתיווך קולטן Fcγ. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מציג בדיקת מונוציטים חד-שכבתית המשתמשת במונוציטים ראשוניים מדם היקפי כדי להעריך פגוציטוזה בתיווך קולטן Fcγ עם תאי דם אדומים מסוג פולי D נגד נוגדנים R₂R₂

.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד תאי דם מונוגרעיניים היקפיים

1. יש להשיג דם מלא אנושי מתורם בריא או ממטופל באמצעות ניקור באמצעות vacutainers המכילים נוגדי קרישה חומצה-ציטראט-דקסטרוז (ACD) (צינורות צהובים).
   הערה: ניתן לאחסן דם מלא ב-ACD בטמפרטורת החדר (18-22 מעלות צלזיוס) עד 36 שעות לפני שממשיכים לשלב הבא. בדרך כלל, 1-2 10-מ"ל צינורות vacutainer של דם שלם מספיקים עבור הבדיקה.
2. יש לדלל את כל הדם ביחס של 1:1 v/v בתווך סל"ד מלא וחם (RPMI-1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 20 mM HEPES ו-0.01 מ"ג/מ"ל גנטמיצין).
3. בודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מהדם המלא המדולל באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, לפי המלצת היצרן (ראה רשימת חומרים). שכב את הדם המדולל לאט מאוד על שיפוע צפיפות (מחומם לטמפרטורת החדר, 18-22 ° C).
   הערה: צמצמו את כמות הערבוב בממשק להפרדה אופטימלית של הדם על ידי שכבות זהירות של תערובת הדם בצורה טיפתית או באמצעות פיפטה.
   1. אפשרו לתערובת הדם לשכב באיטיות מעל החלק העליון של שיפוע הצפיפות על ידי הצבת קצה הפיפט קרוב לשיפוע הצפיפות ועל ידי מתן אפשרות לתערובת הדם לזרום במורד הצד של הצינור לאט מאוד.
   2. בהתאם לקנה המידה של הניסוי, שכבה 10 מ"ל של תערובת דם על גבי 3 מ"ל של שיפוע צפיפות (בצינור 15 מ"ל) או שכבה 35 מ"ל של תערובת דם על גבי 15 מ"ל של שיפוע צפיפות (בצינור 50 מ"ל). בדרך כלל, 10 מ"ל של דם שלם מניב 10 מיליון PBMCs, עם וריאציה מסוימת מתורם לתורם.
      הערה: חשוב מאוד כי אין ערבוב של תערובת הדם עם שיפוע הצפיפות. תערובת הדם צריכה להיות שכבה מעל שיפוע הצפיפות ולעלות לאט עד שכל הדם נמצא על גבי שיפוע הצפיפות.
   3. צנטריפוגו את תערובת השכבות ב 700 x גרם במשך 30 דקות ללא בלמים. יש להפריד את התערובת הצנטריפוגית ל-5 שכבות (מלמעלה למטה): פלזמה, ציפוי באפי (המכיל PBMCs), חומר שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו-RBCs.
   4. הסר והשלך את רוב הפלזמה ואחזר בזהירות את תוכן מעיל באפי (PBMC) לתוך צינור חדש של 15 מ"ל באמצעות פיפטה פסטר ונורת יניקה.
      הערה: הסרת שכבת הפרווה הבאפית נעשית למעשה על ידי מריחת יניקה על פיפטת פסטר תוך ביצוע תנועה סיבובית סביב החלק החיצוני של השכבה, כאשר קצה הפיפטה כנגד הצינור.
4. שטפו את מרכזיות ה-PBMC המבודדות שלוש פעמים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ב-pH 7.3 על ידי צנטריפוגה של 350 x גרם למשך 10 דקות (עם בלמים מלאים) בין השטיפות. הרכיבו מחדש את גלולת PBMC בתווך סל"ד מלא. בהתאם לגודל של הכדור, 3-7 מ"ל של בינוני מספיק.
5. ספרו את ה-PBMC באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר. ספרו רק את התאים שאינם מוכתמים בכחול טריפאן. הרכיבו מחדש את ה-PBMCs ל-1,750,000 תאים/מ"ל בתווך סל"ד מלא.
6. זרעו 400 μL (700,000 תאים) בכל באר של שקופית בת 8 תאים. יש לדגור על השקופית באינקובטור תרבית רקמה בלחות מלאה של 37°C (בתוספת 5% CO₂) למשך שעה אחת כדי לאפשר למונוציטים/מקרופאגים להידבק.

2. טיפול מקדים במונוציטים דבקים

הערה: שלב זה נחוץ רק אם מחפשים דרכים לעכב או לשפר פגוציטוזה.

1. טיפול מראש מונוציטים דבקים עם כל תרופה(ות) או תרכובות של עניין. הרכיבו מחדש את התרופה(ות) או חומר בדיקה אחר לריכוז הרצוי באמצעות מדיום RPMI מלא.
   הערה: לדוגמה, 200 מיקרוגרם / מ"ל של IVIG משמש בדרך כלל כדי להניב עיכוב של 95-100% של phagocytosis בעת שימוש מונוציטים אנושיים.
2. יש לשאוף ולהשליך את הסופרנאטנט המכיל תאים שאינם דבקים מהשקופית בעלת 8 התאים לאחר הדגירה של 1 שעות (לאחר שלב 1.6). החלף אותו עם 400 μL של תרופה או טיפול אחר לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   1. בעת שאיפה והחלפה של תמיסות בשקופית בעלת 8 תאים, יש להקפיד לשלוט בזרימת הנוזלים כך שתאים שנצמדו חלש לא יתרוממו. כמו כן, יש לעבוד עם 2-3 בארות ריקות בלבד בכל פעם ולהימנע מייבוש הבארות.
      הערה: בדרך כלל, כל טיפול מבוצע בטריפליקטים טכניים.

3. אופסוניזציה של R₂R₂ תאי דם אדומים

הערה: Opsonized R₂R₂ RBCs משמשים כבקרה חיובית עבור phagocytosis בתיווך FcγR. Naïve R₂R₂ צריך להיות מאוחסן בתמיסה של Alsever (להארכת חיי המדף) ב 4 ° C עד חודש אחד. התמיסה של אלסבר מיוצרת בתוך החברה ומורכבת מ-0.8% w/v טריסודיום ציטראט (דיהידראט), 1.9% w/v דקסטרוז, 0.42% w/v נתרן כלורי ו-0.05% w/v חומצת לימון (מונוהידראט). אם תאי R₂R₂ אינם זמינים, ניתן להשתמש בתאים אחרים מסוג Rh-פנוטיפ, כגון R₁R₂, R₁R₁, R₁r או R₂r.

1. לשטוף R₂R₂ (cDE/cDE) תאי דם אדומים PBS בסך הכל שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ב 350 x g במשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: כמות RBCs הדרושים תלויה בגודל הניסוי וניתן לחשב אותה לאחור. תמיד לשטוף כמות עודפת של RBCs, שכן RBCs הולכים לאיבוד במהלך כל כביסה עקב ליזה או במהלך הסרת supernatant. לדוגמה, בניסוי עם 5 טיפולים ו -2 בקרות, כולם נערכו בטריפליקטים טכניים, יש בסך הכל 21 בארות. 21 בארות עם 400 μL / באר של תערובת RBC 1.25% מצביעים על כך שיש צורך ב -105 μL של RBC ארוז ואופסוני. 200 μL של RBC צריך להיות שטף בתחילה 150 μL צריך להיות opsonized כדי להבטיח כי יש כמות מספקת של RBCs לשלב phagocytosis.
2. אופסוניזציה של גלולת R₂R_{2 שטופה} עם נוגדנים רב-שבטיים אנטי-D 1:1 v/v מסרום אנושי ודגרה במשך שעה אחת ב-37°C, עם ערבוב לסירוגין.
   הערה: אם נוגדנים רב-שבטיים נגד D אינם זמינים, ניתן להשתמש בנוגדנים חד-שבטיים נגד D, הזמינים מסחרית, או אנטי-D המשמשים בדרך כלל לטיפול מונע חיסוני Rh, אשר ניתן לקבל מבנקי דם או שירותי עירוי. בדיקת אופטימיזציה צריכה להתבצע בהתחלה בעת הגדרת הבדיקה, ובכל פעם החלפת הרבה נוגדנים רב שבטיים un-titered או מעבר נוגדן חד שבטי. זאת על מנת לזהות את הריכוז או הנפח האופטימלי של אנטי-D הנדרש לתוצאת בדיקת אנטיגלובולינים (IAT) של בין 3+ ל-4+ ותוצאת פאגוציטוזה של בין 70-90 RBCs פגוציטוזים לכל 100 מונוציטים שנספרו.
3. שטפו את ה-R₂R₂ בסך הכל שלוש פעמים ב-PBS באמצעות צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות כל אחת.
   הערה: אופסוניזציה מוצלחת של R₂R₂ יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע IAT עקיף. בקצרה, נוגדנים רב-שבטיים משניים אנטי-אנושיים מתווספים כדי לקשור נוגדנים אופסוניוזיים ראשוניים על משטחי RBC, ואת האות המוגבר ניתן לראות בצורה של hemagglutination. פרוטוקול יצרן מפורט ניתן למצוא בקובץ החומרים המשלימים.
4. החזירו את כדורי R₂R₂ שטופים ל-1.25% v/v באמצעות מדיום סל"ד מלא.
   הערה: עודף opsonized R₂R₂ ניתן לאחסן בתמיסה של Alsever ב 4 ° C עד שבוע.

4. פגוציטוזה בתיווך קולטן Fc

1. שאפו את התרופה או הסופרנאטנט הבינוני מהשקופית בעלת 8 התאים והוסיפו 400 μL של תערובת 1.25% v/v R₂R₂. לדגור ב 37 ° C במשך 2 שעות.
2. לאחר שעתיים של דגירה, הסר את התאים באמצעות מתאמי היצרן. יש לטפוח את העודפים R₂R₂ על מגבת נייר. ודא שהמגלשה אינה מתייבשת.
3. מלא של 100 מ"ל עם PBS. השקיעו ושטפו את המגלשה על ידי הזזת המגלשה באיטיות קדימה ואחורה (בסביבות 30-40 פעימות) כדי להסיר את רוב ה-R₂R₂ הלא פגוציטוזי.
4. הסר את השקופית מה- PBS. יש לטפוח את עודפי PBS באמצעות מגבת נייר או טישו ולייבש את המגלשה באוויר.
5. תקנו את המגלשה המיובשת באוויר ב-100% מתנול למשך 45 שניות. לאחר מכן, יבש באוויר את השקופית הקבועה.
   הערה: ניתן לתקן שקופיות בשיטה אחרת המתאימה יותר לצביעה במורד הזרם, כגון כתם גרינוולד-גימסה21 או כתם רייט-גימסה.
6. הרכיבו את המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה Elvanol מתוצרת הבית (או אמצעי הרכבה אחר הזמין מסחרית) והוסיפו coverslips.
   הערה: מדיום הרכבה Elvanol מורכב מ 15% w / v שרף אלכוהול פוליוויניל ו 30% v/v גליצרין ב PBS. התערובת מחוממת עד שכל השרף מומס והגליצרין מעורבב בצורה הומוגנית. ניתן להחליף אותו באמצעי הרכבה אחר הזמין מסחרית.
7. הניחו לתושבת להתייבש למשך הלילה לפני הכימות.

5. כימות פגוציטוזה

1. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ועדשה אובייקטיבית 40X, כימות ידני של כמות האירועים הפאגוציטיים על ידי ספירת לפחות 200 מונוציטים ומספר הפאגוציטוזים R₂R₂ בתוך מונוציטים אלה. יש מונה אחד בכל יד כדי לכמת בו זמנית את מספר מונוציטים ואת מספר phagocytosed R₂R₂.
2. קבל את האינדקס phagocytic הממוצע על ידי חלוקת מספר phagocytosed R₂R₂ במספר מונוציטים והכפלה ב 100. בטא את הנתונים כממוצע (אינדקס פגוציטים ממוצע) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640	RPMI 1640	₪220
מלח חוצץ פוספט	סיגמא	D8537
שקופיות בנות 8 תאים	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) תאי דם אדומים			זמין מסחרית (למשל, http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ מגיב-אדום-תאי דם)
אנטי-D רב-שבטי מסרום אנושי	גמא מוצרים ביולוגיים	דין 02247724	ניתן להחליף עם anti-D חד שבטי זמין מסחרית או עם Rh immuno globulin
100% מתנול	קלדון	6700-1-42
החלקות כיסוי	VWR	48366 067