מדידת אלורטיאקטיביות באוכלוסייה מעורבת של תאי T

תקציר

מקור: Juvet, S. C. et al., Measurement of T cell alloreactivity using Imaging Flow Cytometry.J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים שיטה להערכת אלורטיות באוכלוסיות מעורבות של תאי T על ידי התבוננות באינטראקציות עם תאים דנדריטיים נושאי אלואנטיגן, המובילות להיווצרות סינפסות אימונולוגיות. צביעה דיפרנציאלית וכימות של כפילים המכילים סינפסות באמצעות ציטומטריית זרימה חושפים אלורטיות של תאי T.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים וחומרים נדרשים

1. הכינו מי מלח חוצצי פוספט (PBS) המכילים 2% סרום בקר עוברי (FBS) ("חיץ שטיפה"). הכינו PBS עם סרום עגל עוברי 2% (FCS) המכיל 0.1% חומר ניקוי לא יוני ("חיץ שטיפת פרם"; ראו טבלת חומרים). הכינו PBS עם 1.5% פורמלדהיד.
   הערה: פורמלדהיד הוא חומר מאכל ועלול להיות מסרטן ויש לטפל בו תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
2. הכינו PBS המכיל 2% FBS ו-0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) להפרדת תאים מגנטית ("מאגר MCS").
3. הכן 50 מיקרוגרם / מ"ל phalloidin-fluorescein isothiocyanate (Phalloidin-FITC) ב dimethyl sulfoxide (DMSO). הכינו כתם גרעיני במינון 1 מ"ג/מ"ל (למשל 1 מ"ג/מ"ל 7-אמינו אקטינומיצין D (7-AAD) בצבע DMSO או ביס-בנזימיד; ראו טבלת חומרים) ב-DMSO. הכינו נוגדנים בעלי תווית פלואורוכרום המתאימים לתאים המעניינים ולציטומטר זרימת ההדמיה.
4. להשיג רקמות של בעלי חיים (למשל, בלוטות לימפה וטחול) כמקור לתאי T ורקמות אלוגניות של בעלי חיים (למשל, טחול ומח עצם) כמקור לתאים או אבות מציגי אנטיגן.
5. הכינו מדיום תרבית תאים (למשל, Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 או Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) בתוספת 10% FBS), 50 μM 2-mercaptoethanol, פניצילין וסטרפטומיצין והשיגו לוחות תרבית תאים של 24 ו/או 96 בארות.

2. הכנת תאים מציגי אנטיגן (APC)

הערה: בתיאוריה, ניתן לבחון כל אוכלוסיית נגמ"ש בשיטה זו. תאים דנדריטיים לא בוגרים שמקורם במח עצם עכבר (DCs) כנגמ"שים נתבעו במקרה זה. קיימים פרוטוקולים רבים ליצירת תאים אלה. בקצרה, נעשה שימוש בפרוטוקול הבא.

1. יש לשטוף את מח עצם הירך ואת tibias לתוך RPMI 1640 או DMEM.
2. העבירו את התאים המרחפים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר חתיכות קטנות של עצם ופסולת.
3. משחררים את התאים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן ליז תאים אדומים באמצעות חיץ אמוניום כלורי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) והשהה מחדש את גלולת התא.
5. לשטוף תאים ב 5 - 10 מ"ל של חיץ שטיפה, גלולה על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות), ולהשעות מחדש את גלולת התא.
6. העשירו את הקודמנים ההמטופויטיים מעל עמודת הפרדת תאים על ידי תיוג התאים בנוגדנים אנטי-CD3 ביוטינילציה (5 מיקרוגרם/מ"ל), אנטי-B220 (5 מיקרוגרם/מ"ל), אנטי-MHC Class II (1 מיקרוגרם/מ"ל) ונוגדנים נגד CD11b (5 מיקרוגרם/מ"ל).
7. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) ו להשעות מחדש את גלולת התא.
8. דגרו על התאים עם מיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-ביוטין (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
9. שטפו ושחררו את התאים (400 x גרם, 5 דקות) והשהו אותם מחדש ב-1 מ"ל של מאגר MCS לפני הסרת התאים המסומנים באמצעות עמודת הפרדת תאים מגנטית מסוג בחירה חיובית גדולה (LS) עם 3 מ"ל של מאגר MCS וממוקמת במגנט שלה. לשטוף את העמוד 3 פעמים עם 3 מ"ל של מאגר MCS; הזרימה תכיל את התאים הרצויים.
10. תרבית את התאים העוברים דרך העמודה במשך 6 ימים ב- RPMI 1640 או DMEM בתוספת 2 ng/mL גורם מגרה מושבת מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) ו- 2 ng/mL של גורם גדילה טרנספורמציה אנושי רקומביננטי β1 (TGFβ1). יש להחליף מחצית מהמדיום כל יומיים בתווך מלא טרי המכיל 2 ננוגרם/מ"ל, GM-CSF ו-TGFβ1.
    הערה: ל-TGFβ1 אנושי יש פעילות בתאי עכבר. הנתונים נוצרו באמצעות DCs בוסריים אלה. תאים אחרים (למשל, תאי B ותאי DCs בוגרים) עשויים להתאים כ-APCs אך לא נבדקו בבדיקה זו.
11. Cryopreserve DCs ב 90% סרום / 10% DMSO ולאחסן בחנקן נוזלי; לשחזר ביום השימוש. לפני השימוש, יש לספור את מספר ה-DCs הקיימים בהמוציטומטר באמצעות הרחקת טריפאן כחול. יש להשהות מחדש את כדורית התא בתווך תרבית בצפיפות המתאימה (ראה שלב 4.1) לפני השימוש בסעיף 4.

3. הכנת תאי T

1. השתמש בשיטות בחירה שלילית כדי להימנע משידור בשוגג של אותות הפעלה או עיכוב לתאים.
   הערה: בדוגמה זו, תאי T ^CD4+ מוכנים לניתוח.
   1. כדי להכין תאי CD4⁺ T מטחול העכבר, מועכים את הטחול דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר באמצעות בוכנה של מזרק. שטפו את מסננת התא עם מאגר שטיפה.
   2. גלולה את התאים המרחפים על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) ולאחר מכן lyse את התאים האדומים על ידי השעיה מחדש של הגלולה בחיץ אמוניום כלורי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) ומשעימים מחדש את הכדור.
   4. לשטוף את התאים ב 5 - 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות). השהה מחדש את הכדור.
   5. לצבוע את התאים עם נוגדנים biotinylated CD8, קומפלקס histocompatibility גדול Class II (MHC II, 1 מיקרוגרם / מ"ל), ו CD19 (5 מיקרוגרם / מ"ל). יש לדגור במשך 10 דקות ב-4°C.
   6. לשטוף את התאים ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות). השהה מחדש את הכדור.
   7. לדגור על התאים עם מיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-ביוטין (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
   8. לשטוף את התאים ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות); להשעות מחדש את הכדור.
   9. השהה מחדש את התאים ב- 1 מ"ל של מאגר MCS והעשר את תאי CD4⁺ T על עמודת הפרדת תאים מגנטית עם 3 מ"ל של מאגר MCS על מגנט. שטפו את העמוד 3 פעמים עם 3 מ"ל של מאגר MCS. זרימת עמודה תכיל את תאי T המועשרים.
2. על ידי ציטומטריית זרימה סטנדרטית, להעריך את טוהר תאי T באמצעות aliquot של התאים שנבחרו שלילי. לצבוע את התאים באמצעות פלואורוכרום-סטרפטאווידין מצומד (כדי לזהות תאים עם תווית ביוטין שהיו צריכים להיות מוסרים על העמודה) ונוגדן או נוגדנים כדי לזהות את אוכלוסיית תאי T המעניינת (CD4 במקרה זה); טוהר של ≥85% מקובל.
   1. ספירת תאי T בהמוציטומטר על ידי אי הכללת כחול טריפאן (≥90% כדאיות מקובלת).
      הערה: מאגר MCS מכיל EDTA, שיש להסיר לפני הבדיקה. כדי להשיג זאת, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) ולשטוף אותם 1 מ"ל של חיץ לשטוף. משחררים שוב את התאים (400 x גרם, 5 דקות) ומשהים מחדש בתווך התרבית בצפיפות המתאימה (ראה שלב 4.1).

4. דגירה משותפת של תאי T ו-DCs

1. זרע תאי T ו-DCs ביחס של 2:1 T:DC בצלחת תרבית תאים של 24 בארות או 96 בארות. ודא כי נפח התרבית הסופי הוא ≤500 μL עבור לוחות 24 בארות או ≤50 μL עבור לוחות 96 בארות.
   הערה: נפחים קטנים יותר מעודדים אינטראקציות בין תאים ומאפשרים מקום למאגרי הקיבוע הבאים.
   1. התאימו את מספרי התאים המדויקים באופן אמפירי, אך כמדריך כללי, השתמשו בתאי T בגודל 1 x 10⁶ ובתאי T בגודל 0.5 x 10⁶ DCs לכל באר (לוח 96 באר). אלה צריכים להיחשב למספר המינימלי של תאים מכיוון ששימוש בפחות תאים מקשה על ספירת הסינפסות החיסונית.
      1. כדי להגדיל את מספר התאים, הגדר בארות ומאגר משוכפלים לאחר שלב 5 (קיבוע).
         הערה: בעת הקמת בארות משוכפלות, רצוי לזרוע תחילה DCs בכל הבארות ולאחר מכן לזרוע תאי T בכל הבארות; זה ממזער פערים בזמן הדגירה בין בארות.
2. לדגור על הצלחת במשך 4 שעות ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO₂.

5. תיקון תאים בצלחת

1. הוסיפו פי 3 מנפח התרבית של 1.5% פורמלדהיד ב-PBS לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות; חשוב לתקן תאים לפני הוצאתם מהצלחת כדי למזער את ההפרעה לאינטראקציות בין תאים.
2. מעבירים תאים בצלחת לצינורות לשטיפה וכתמים לאחר מכן. בשלב זה, הקצו תאים נוספים לבקרות עם כתם יחיד. מלבד בקרות אלה, יש להכתים את התרבית כולה בקוקטייל הנוגדנים (ראה שלב 4.1.1).

6. תאי צביעה

1. תאי צביעה ב 100 μL של חיץ כביסה המכיל קוקטייל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום הרצוי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
   הערה: הקוקטייל כולל נוגדנים ספציפיים לתאי T ונוגדנים ספציפיים ל-APC. יש לבחור פלואורוכרומים כך שניתן יהיה להבחין ביניהם באמצעות תצורת ציטומטר זרימת ההדמיה. בניסויים המוצגים כאן נעשה שימוש ב-CD11b מצומד פלואורופור כחול (5 מיקרוגרם/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ו-CD90.2 מצומד APC (5 מיקרוגרם/מ"ל).
2. לשטוף את התאים ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם. יש להשהות מחדש את התאים במאגר שטיפת פרם המכיל פאלואדין FITC בטמפרטורה של 0.05-0.5 מיקרוגרם/מ"ל ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כשהוא מוגן מפני אור.
   הערה: ריכוזי Phalloidin FITC של כ-0.1 מיקרוגרם/מ"ל פועלים היטב עבור תאי עכבר, אך הריכוז המתאים צפוי להשתנות בהתאם לספק, סוג התא וציטומטר זרימת ההדמיה.
3. שטפו את התאים ב-1 מ"ל של חיץ פרם/שטיפה וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. דקנט את הסופר-נטנט. יש להשהות מחדש את התאים בחיץ פרם/שטיפה המכיל צבע גרעיני בריכוז המתאים (למשל, כ-25 מיקרוגרם/מ"ל 7-AAD) ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור.
4. שטפו את התאים ב-1 מ"ל של חיץ פרם/שטיפה וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. דקנט את הסופר-נטנט. שטפו את התאים פעם אחת בחיץ שטיפה, גלולה והשהו מחדש ב 50 - 100 מיקרוליטר של חיץ שטיפה, והעבירו את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות ומכוסות.
5. המשך לרכישת נתונים באופן מיידי או אחסן את התאים ב -4 °C מוגנים מאור עד מספר ימים לפני הרכישה בציטומטר זרימת ההדמיה.
   הערה: תאים אוחסנו בהצלחה בדרך זו למשך עד 7 ימים. אחסון ארוך יותר עשוי להיות אפשרי אך לא נבדק.

7. רכישת נתונים

1. אתחל והגדר את ציטומטר זרימת ההדמיה בהתאם להוראות היצרן. ודא יציבות של ליבת הזרימה לפני איסוף נתונים כלשהם.
2. שמרו ערוץ אחד לרכישת תמונות בשדה בהיר. השג נתוני בקרה של כתם יחיד כאשר ערוץ brightfield כבוי.
   1. לחץ על כפתור "טען" והכנס צינור המכיל דגימה מוכתמת במלואה (דגימה שהוכתמה בכל הפלואורוכרומים הנדרשים) למחזיק.
   2. בחלון "סביבת עבודה", בחר וצור תרשים פיזור חדש עם יחס גובה-רוחב על פני סינגלי השטח והשער שבהם יחס הגובה-רוחב קרוב ל- 1. צרו תרשים פיזור חדש לכל ערוץ שנעשה בו שימוש (עוצמת הערוץ בציר האופקי).
   3. עבור כל פלואורוכרום, בדוק את האוכלוסייה החיובית, ואם נדרש, להתאים את מתח הלייזר בתיבה "תאורה".
   4. פרקו את הצינור וטענו את הצינור הראשון המוכתם ביחיד.
   5. בתיבה "הגדרות רכישה", הקלד את שם הדוגמה והגדר את מספר האירועים שיש לאסוף; אם זהו כתם יחיד (לבקרות פיצוי), 1,000 - 2,000 אירועים מספיקים.
   6. בתיבה "ערוצים", בחר את הערוצים שכל דגימה הוכתמה בהם. לבקרי צביעה יחידה, יש לבחור את כל הערוצים עם שדה בהיר ופיזור צדדי. לחץ על כפתור "הקלט" תחת התיבה "רכישה"; כאשר מספר האירועים מגיע לסף שצוין, הרכישה תיפסק באופן אוטומטי.
   7. לחץ על כפתור "החזר" כדי לפרוק את הצינור. חזור על שלבים 7.2.4 - 7.2.6 עבור כל בקרת כתם יחיד. בהתאם לציטומטר ולתוכנה, ייתכן שלא ניתן יהיה להגדיר את כל השערים המוצגים באיור 1 במהלך הרכישה (גטינג מדויק יותר מתבצע במהלך הניתוח; ראה סעיף 8).
3. רכוש דוגמאות לגבי דגימות מוכתמות בודדות (בשלב 7.2), אך בתיבה "ערוצים", בחר את כל הערוצים הדרושים, כולל ערוץ brightfield.
   1. לפני הקלטת הנתונים, בדוק שעוצמת הערוץ מתאימה לזיהוי אוכלוסיות התאים הרצויות. אם לא, התאם את הגדרות הלייזר והקלט מחדש פקדי כתם יחיד באמצעות ההגדרות החדשות, כמתואר בשלב 7.2.
   2. עבור כל מדגם, לרכוש כמה עשרות אלפי אירועים.
      הערה: ברוב התנאים, אירועי מגע בין תאים הם מיעוט קטן ממספר התאים הכולל (רובם הם תאים בודדים). באופן כללי, רצוי שיהיו לפחות 100 אירועים בשער המגע הסופי של הממברנה.

תוצאות

איור 1. אסטרטגיית Gating המשמשת לזיהוי סינפסות חיסוניות אלוראאקטיביות. A. אירועים במיקוד מגודרים מכל האירועים על-ידי סקירת תמונות תאים בהתבסס על ריבוע ממוצע השורש של קצב השינוי של פרופיל עוצמת התמונה (Gradient RMS) באמצעות ערוץ brightfield (ערוץ 4, Ch04), כמתואר בטקסט. B. בין אירועים במיקוד, כפילים נבדלים מתאים בודדים על-ידי התוויית יחס גובה-רוחב לעומת שטח עבור ערוץ שדה בהיר. תאים בו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט	מגוון	משתנה
חומצה Ethylenediamenetetraacetic, תמיסה 0.5M	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9260G
חומר ניקוי ניוני Triton X-100	סיגמא-אולדריץ'	X100
בטא-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M3148
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	D8418
פורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	F1635	התמיסה היא 37% פורמלדהיד ולכן יש לדלל אותה 25 פעמים לקבלת תמיסה של 1.5%
מסננות תאים, גודל נקבוביות 70 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	08-771-2
פלואדין-פלואורסצאין איזותיוציאנט	סיגמא-אולדריץ'	P5282
7-aminoactinomycin D	תרמו פישר סיינטיפיק	A1310	בנייה מחדש ב- DMSO
אלופיקוציאנין מצומד נגד עכבר CD90.2	eBioscience	17-0902
פסיפיק כחול מצומד נגד עכבר CD11b	eBioscience	48-0112	כחול פסיפי הוחלף ב-eFluor 450
CD3 נגד עכבר Biotinylated	eBioscience	13-0032
MHC Class II נגד עכבר שעבר ביוטינילציה	eBioscience	13-5321
Biotinylated נגד עכבר B220	eBioscience	13-0452
CD8 נגד עכבר Biotinylated	eBioscience	13-0081
Biotinylated נגד עכבר CD19	eBioscience	13-0193
מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין	Miltenyi ביוטק	130-090-485
עמודות LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401
מפריד תאים מגנטי MidiMACS	MIltenyi ביוטק	130-042-302
עכבר רקומביננטי GM-CSF	פפרוטק	315-03
TGFβ1 אנושי רקומביננטי	פפרוטק	100-21	ל-TGFβ1 האנושי יש פעילות על תאי עכבר
Amnis ImageStream X סימן II	Amnis/EMD Millipore	לא ישים	ציטומטר זרימה הדמיה; פרטים זמינים בכתובת http://www.emdmillipore.com/
תוכנת IDEAS	Amnis/EMD Millipore	לא ישים	הורדה חינם (נדרשת הרשמה): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
מדיום תרבית תאים	מגוון	משתנה
סרום בקר עוברי	מגוון	משתנה
צלחות תרבית תאים	מגוון	משתנה