זיהוי וספירה של תאי מערכת החיסון בנוזל שטיפה סימפוני לפי ציטומטריית זרימה

תקציר

מקור: Van Hoecke, L. et al., Bronchoalveolar washage of Murine Lungs to Analyze inflammatory cell filtration.J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים את השימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולספור תאים חיסוניים שונים בנוזל שטיפה ברונכואלבאולרי. בתחילה, מזהים תאים חיסוניים בודדים באמצעות צבע כדאיות, ולאחר מכן צביעה דיפרנציאלית של חלבוני סמן פני השטח, המאפשרת ספירה מדויקת של כל סוג תא.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנה

1. נוזל שטיפה
   1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת עם 100 מיקרומטר חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA).
      הערה: כדי למדוד את רמות החלבון בנוזל שטיפת הסימפונות (BAL), מומלץ להוסיף מעכבי פרוטאז כדי למנוע פעילות פרוטאז בנוזל BAL.
2. צנתר
   1. יצירת קטטר על ידי החדרת מחט 23 גרם לתוך צינורות פלסטיק שקוף פוליאתילן 21 G (קוטר פנימי: 0.58 מ"מ, קוטר חיצוני: 0.965 מ"מ, ואורך: 0.5 ס"מ). ניתן להשתמש גם בצנתרים מוכנים מראש.
3. חומרי הרדמה
   1. הכינו חומר הרדמה סופני, רצוי כזה שגורם לדום נשימה (למשל, תמיסת ברביטורט כמו נתרן פנטוברביטל (>100 מ"ג/ק"ג) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)).
      הערה: מומלץ להשתמש בהרדמה מוזרקת במקום בהרדמה בשאיפה, שכן הרדמה בשאיפה עלולה להשפיע על תכולת נוזל ה-BAL. CO₂, למשל, יש השפעה על ה- pH של הדם וכתוצאה מכך על חלוקה מחדש של תרכובות שונות.
4. אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר ליזה של תאי דם אדומים
   1. הכן מאגר ליזה ACK על ידי המסת 8.29 גרם של אמוניום-כלוריד (NH₄Cl) ו 1 גרם של אשלגן ביקרבונט (KHCO₃) ב 1 L של H₂O עם 100 מיקרומטר EDTA; ניתן לרכוש מאגר ליזה של תאי דם אדומים גם ממקור חיצוני.

2. ביצוע שטיפת סימפונות (BAL)

1. החדרת הצנתר לקנה הנשימה
   1. המתת חסד העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal של מנה קטלנית של הרדמה barbiturate קצר טווח באמצעות מחט 26 גרם. כדי לאשר הרדמה קטלנית נכונה, צבוט את הכף האחורית של העכבר עם מלקחיים כדי לבדוק את רפלקס כף הרגל.
   2. הניחו את בעל החיים על גבו על צלחת כירורגית וקבעו את העכבר על ידי הצמדת הגפיים.
   3. יש לרסס אתנול 70% על הצוואר לחיטוי. בצע חתך בעור הצוואר ליד קנה הנשימה באמצעות אזמל.
   4. פתח את העור כדי לחשוף את בלוטות הרוק. להפריד את בלוטות הרוק באמצעות צבתות לחשוף את שריר sternohyoids. חותכים את השריר סביב קנה הנשימה באמצעות צבתות כדי לחשוף את קנה הנשימה.
   5. מניחים חוט כותנה מתחת לקנה הנשימה באמצעות צבתות.
   6. נקבו בזהירות את אמצע קנה הנשימה החשוף בין שתי טבעות סחוס עם מחט 26 גרם. יש להקפיד שלא לפגוע עוד בקנה הנשימה.
   7. הכנס את הקטטר כ 0.5 ס"מ לתוך קנה הנשימה. ודא כי הצנתר אינו מוכנס רחוק מדי לתוך קנה הנשימה, כמו זה יכול להוביל נזק למבנה הריאה.
   8. ייצבו את הצנתר על ידי קשירת קנה הנשימה סביב הצנתר באמצעות חוט הכותנה שהונח בשלב 2.1.5. אם הצנתר אינו קשור מספיק, תמיסת המלח המאוזנת המוזרקת עשויה לזרום לכיוון החלק העליון של דרכי הנשימה במקום למטה לתוך הריאות.
2. לאסוף את נוזל השטיפה
   1. טען מזרק 1 מ"ל עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית עם 100 מיקרומטר EDTA.
   2. חברו את מזרק 1 מ"ל לקטטר והזריקו בעדינות את תמיסת המלח/EDTA לריאה.
   3. שאפו את התמיסה בעדינות תוך כדי עיסוי בית החזה של העכבר. אם נוזל השאיפה אינו נראה במזרק, הכנס בזהירות את הצנתר מעט למטה או במעלה קנה הנשימה.
   4. הסר את המזרק מהמחט והעבר את נוזל השטיפה שהתאושש לתוך צינור 15 מ"ל מונח על קרח. בדרך כלל, 700 - 900 μL של BAL הוא התאושש מ 1 מ"ל של פתרון מוזרק.
   5. חזור על שלבים 2.2.1 - 2.2.4 פעמיים נוספות.
      הערה: אם המטרה היא לנתח את התוכן הלא תאי, מומלץ לרכז את הדגימות המאוגדות כאשר יש בעיות רגישות.

3. איסוף המרכיבים התאיים והלא תאיים של נוזל BAL

1. צנטריפוגה את נוזל השטיפה במשך 7 דקות ב 400 x גרם ו 4 ° C.
2. אספו את הסופרנאטנט והשתמשו בו מיד לניתוח נוסף (למשל, בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים, ELISA) או הקפאו בטמפרטורה של -80°C. שמרו את גלולת התא כדי לנתח את זרם התאים בריאות.
3. להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של ACK lysing buffer.
   הערה: שלב זה מבטיח את הליזה של אריתרוציטים תוך שמירה על תאי הדם הלבנים שלמים.
4. דגירה למשך 2 דקות ב- RT.
   הערה: כדי להפחית את השונות הנגרמת על ידי ליזה של תאים אדומים, שלב זה לא צריך להתבצע במשך יותר מ 2 דקות.
5. הוסף 1 מ"ל של PBS קר כדי לדלל את מאגר ACK lysing.
6. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב- 400 x גרם ו- 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בנפח מתאים של PBS לניתוח במורד הזרם (ראה להלן).
   הערה: נפח PBS תלוי במחקר במורד הזרם שיבוצע.

4. ניתוח סוגי התאים השונים בנוזל BAL על ידי ציטומטריית זרימה

הערה: אפשרות אחת היא לנתח את ההרכב התאי המוחלט והיחסי של נוזל BAL על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה. מטרת מאמר זה היא להרחיב על הטכניקה של BAL. ציטומטריית זרימה היא טכניקה מיוחדת בפני עצמה. מומלץ לקרוא מאמרים מיוחדים על טכניקת ציטומטריית זרימה. נעשה שימוש בנוגדנים המצומדים לפלואורופור המזהים אנטיגנים על פני השטח (ראו טבלה 1) ספציפיים לסוג תא מסוים. על ידי שימוש באסטרטגיית gating, ניתן לזהות תאי T, מקרופאגים, תאים דנדריטיים, תאי B, אאוזינופילים ונויטרופילים בחלק התא של BAL.

1. צביעת פני התא
   הערה: חשוב לכלול את כל הבקרות הקריטיות לניתוח ציטומטריית זרימה. דרושים שלושה סטים של צינורות (ראה טבלה 2): (1) צינורות המכילים את הדגימות; (2) צינורות עם תאי BAL לכל נוגדן-פלואורופור ליצירת כתמים בודדים; זה מאפשר לקבוע את המתחים עבור כל ערוץ על ציטומטר זרימה; (3) צינורות עם חרוזים לכל נוגדן-פלואורופור ליצירת כתמים בודדים; זאת כדי לקבוע את מטריצת הפיצוי.
   1. בצע ערבוב של הנוגדנים ובלוק Fc (anti-CD16/CD32) ב- PBS בדילולים המתאימים (ראה טבלה 2). יש לקבוע את דילול העבודה האופטימלי עבור כל נוגדן לפני הניסוי.
   2. להשעות מחדש את התאים ב 50 μL של תערובת הנוגדנים עבור הדגימה ולהוסיף 50 μL של נוגדן מדולל כראוי לבקרות קריטיות.
      הערה: את הצביעה ניתן לבצע בפלטה בצורת U בעלת 96 בארות. זה מאפשר להפחית בקלות את נפח הכתם ולהריץ כמויות משמעותיות של דגימות.
   3. לדגור במשך 30 דקות בחושך ב 4 °C (75 °F).
   4. צנטריפוגה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 400 x גרם ו-4°C. השליכו את הסופרנטנט.
   5. השהה מחדש את התאים ב- PBS לנפח סופי של 200 μL.
      הערה: נפח סופי זה תלוי בנפח המינימלי שאליו ציטומטר הזרימה יכול לגשת. זה יכול להיות שונה מעט בין מכונות. בנוסף, נפח הקריאה תלוי במספר התאים ו/או בזמן שייקח לדגימה לרוץ בציטומטר הזרימה.
   6. השתמש בדוגמאות ובפקדים לניתוח ציטומטרי זרימה.
      הערה: כדי לקבוע את מספר התאים המוחלט של אוכלוסיות התאים השונות, יש להוסיף ספירת חרוזים. הוסיפו את אותו מספר חרוזים (± 25,000 חרוזים) לכל דגימה ממש לפני המדידה. על-ידי שימוש בפיזור קדימה ובצד, ספירת חרוזים יכולה להיות מזוהה על-ידי ציטומטריית זרימה (ראו איור 1). לאחר מכן, ניתן לחשב את המספר המוחלט של התאים במדגם על ידי השוואת היחס בין אירועי חרוזים לאירועי תאים. ניתן להשתמש בנוסחה הבאה:
      
2. ניתוח ציטומטרי זרימה
   הערה: הניתוח הציטומטרי של הזרימה צריך להיעשות מיד לאחר השלמת פרוטוקול הצביעה. יש להשתמש בציטומטר זרימה עם לייזרים ומסננים מתאימים לזיהוי אותות. טבלה 3 מציגה סקירה כללית של הלייזרים והמסננים הדרושים למחקר המתואר בכתב יד זה. למידע נוסף על ניתוח ציטומטרי של זרימה, ראו Adan et al..
   1. הגדר את השערים הראשיים בהתבסס על הפיזור קדימה וצדדית, למעט פסולת וכפילים (ראה איור 1).
   2. התאימו את המתח ואת הפיצוי לחפיפה ספקטרלית בעזרת התאים והחרוזים המוכתמים הבודדים.
      הערה: הגדרות אלה שונות עבור כל ציטומטר זרימה ויש לבדוק אותן לפני כל ניסוי. לניתוח זרימה נכון, מתחי הפיזור קדימה וצידי הם קריטיים. פיזור נכון קדימה ובצד יכול לסייע בזיהוי ואישור זהות התאים המנותחים. כדי לקבוע מתחים אלה, יש להפעיל תחילה דגימה לא מוכתמת.
   3. הגדירו שערי פלואורסצנטיות עבור האנטיגן שעל פני השטח (ראו איור 1) ונתחו את הדגימות.

טבלה 1: בחירה של אנטיגנים בפני השטח של תאי מערכת החיסון. טבלה זו מספקת רשימה של אפיטופים של פני השטח המשמשים לאפיון סוגי התאים השונים. שילובים של מספר סמנים יידרשו כדי להגדיר באופן אמין סוג תא מסוים.

אנטיגן	סוג תא
אשכול בידול 3 (CD3)	מבוטא על תאי T
אשכול בידול 11c (CD11c)	ביטוי גבוה על רוב התאים הדנדריטיים, אך גם על מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים וכמה תאי B.
אשכול בידול 11b (CD11b)	מבוטא על פני השטח של לויקוציטים רבים, כולל מונוציטים, נויטרופילים, תאי הרג טבעיים, גרנולוציטים ומקרופאגים.
SiglecF	מקרופאגים מכתשית ואאוזינופילים.
מ.ה.צ'י	בדרך כלל נמצא רק על תאים מציגי אנטיגן כגון תאים דנדריטיים, פגוציטים חד-גרעיניים ותאי B.
CD19	אנטיגן B-לימפוציטים
Ly-6G	סמן למונוציטים, גרנולוציטים ונויטרופילים

טבלה 2. רשימת פקדים שיש לכלול. טבלה זו מציגה את כל הבקרות הדרושות לפרשנות מדויקת של התוצאות המתקבלות.

דגימות
צינור	אנטיגן-פלואורופור שיתווסף לתאים	ריכוז מלאי נוגדנים (מ"ג/מ"ל)	דילול נוגדנים	נפח כולל (μL)
	צבע כדאיות הניתן לתיקון	0.2	1/1000	50
	CD11c	0.2	1/800	50
	SiglecF	0.2	1/100	50
דוגמה X	מ.ה.צ'י	0.2	1/200	50
	CD3	0.2	1/200	50
	CD19	0.2	1/200	50
	CD11b	0.2	1/200	50
	Ly6G	0.2	1/200	50
בקרות מתח
צינור	אנטיגן-פלואורופור שיתווסף לתאים	ריכוז מלאי נוגדנים (מ"ג/מ"ל)	דילול נוגדנים	נפח כולל (μL)
תאים לא מוכתמים	/	/	/	50
תאים מוכתמים בודדים	צבע כדאיות הניתן לתיקון	0.2	1/1000	50
תאים מוכתמים בודדים	CD11c	0.2	1/800	50
תאים מוכתמים בודדים	SiglecF	0.2	1/100	50
תאים מוכתמים בודדים	מ.ה.צ'י	0.2	1/200	50
תאים מוכתמים בודדים	CD3	0.2	1/200	50
תאים מוכתמים בודדים	CD19	0.2	1/200	50
תאים מוכתמים בודדים	CD11b	0.2	1/200	50
תאים מוכתמים בודדים	Ly6G	0.2	1/200	50
בקרות פיצוי
צינור	אנטיגן-פלואורופור שיתווסף לחרוזים	ריכוז מלאי נוגדנים (מ"ג/מ"ל)	דילול נוגדנים	נפח כולל (μL)
חרוזים לא מוכתמים	/	/	/	200
חרוזים מוכתמים בודדים	CD11c	0.2	1/2000	200
חרוזים מוכתמים בודדים	SiglecF	0.2	1/2000	200
חרוזים מוכתמים בודדים	מ.ה.צ'י	0.2	1/200	200
חרוזים מוכתמים בודדים	CD3	0.2	1/2000	200
חרוזים מוכתמים בודדים	CD19	0.2	1/2000	200
חרוזים מוכתמים בודדים	CD11b	0.2	1/400	200
חרוזים מוכתמים בודדים	Ly6G	0.2	1/200	200

טבלה 3: סקירה כללית של הלייזרים והמסננים של ציטומטר הזרימה שנעשה בהם שימוש במחקר זה.

סוג לייזר	הגדרת מסנן
	505 LP	525/50
פול (488 ננומטר)	550 LP	575/26
100 mW	670 LP	685/35
	750 LP	780/60
סגול 405 נאנומטר		450/50
100 mW
אדום 633 ניוטון מטר		660/20
70 mW	750 LP	780/60

תוצאות

איור 1: אסטרטגיית Gating לזיהוי ציטומטרי של זרימה של מקרופאגים, תאים דנדריטיים, תאי T, תאי B, נויטרופילים ואאוזינופילים בנוזל BAL. תאי BAL בודדו באמצעות פרוטוקול BAL המתואר. התאים בודדו מעכברים 24 שעות לאחר החדרה תוך טרכאלית של ליפופוליסכריד. ספירת חרוזים ותאים זוהתה על סמך תכונות פיזור קדימה וצדדית. בשער התא זוהו תאים בודדים באמצעות פיזור קדימה וצדדית. באוכלוסייה אחרונה זו זוהו תאים שהיו בחיים. לאחר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת מלח מאוזנת	תרמו פישר סיינטיפיק	14175-129
Ethyleendiaminetetra חומצה אצטית	סיגמא-אולדריץ'	E6511	מעצבן
23G x 1 1/4 מחט	הנקה סאס וולף	4710006030	גודל: 0,60 x 30 מ"מ
26 גרם x 1/2 נילד	הנקה סאס וולף	4710004512	גודל: 0,45*12 מ"מ
צינורות פלסטיק	טכנולוגיה רפואית BD	427411	צינורות פוליאתילן, ת.ז. 0.58 מ"מ (0.023 אינץ') O.D. . 965 מ"מ (0.38 אינץ') 30.5 מ' (100 אינץ')
נתרן pentobarbital	Kela NV	514
פוספט מלח חוצץ	לונזה	BE17-516F	PBS ללא Ca++ Mg++ או פנול אדום; סטרילי מסונן
1 מ"ל מזרקים	הנקה סאס וולף	5010.200V0	לא פירוגני ולא רעיל
מלקחיים	GmbH כלים מדעיים משובחים	91197-00
מספריים כירורגיים	GmbH כלים מדעיים משובחים	91460-11
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	ה. גייר	7696705	ללא רנאז/דנאז/אנדוטוקסין
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	ה. גייר	7696702	ללא רנאז/דנאז/אנדוטוקסין
צינור מיקרוצנטריפוגה 1,5 מ"ל	סיגמא-אולדריץ'	0030 120.094	פוליפרופילן
מיקרוצנטריפוגה	סיגמא-אולדריץ'	5415R
צנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק	75004030
חיץ שוכב אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK)	לונזה	10-548E	סטרילי מסונן
חי/מת -efluor506	Ebioscience	65-0866-18	צבע כדאיות הניתן לתיקון
CD11c-PE-cy7	eBiosciences	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	ביואגדה	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiosciences	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	ביואגדה	127621
ספירה מוחלטת של חרוזים	לייף טכנולוגיות אירופה בע"מ	C36950
אנטי-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
צלחת אחסון 96-well 340 μl	בז	353263	תחתית V, פוליפרופילן טבעי
ציטומטר זרימה	BD Biosciences
צנתר	BD Biosciences	393202