1. הגדרת MIC משכפל ולא משכפל90 מבחנים
- יש לחסן את M. tuberculosis, M. bovis BCG או M. smegmatis ב-OD580 של 0.01-0.1 ולהרחיב לשלב אמצע הלוג (OD580 ~0.5) ב-Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 המכיל 0.2% גליצרול, 0.2% דקסטרוז, 0.5% אלבומין ו-0.085% NaCl) או 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 המכיל 0.2% גליצרול ו-10% תוסף OADC).
- גדל M. tuberculosis ו-M. bovis BCG כ~20 מ"ל תרביות עומדות בצלוחיות תרבית תאים ו-M. smegmatis עם ניעור בפוליפרופילן עגול תחתית (תרבית 4 מ"ל) או 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים (תרבית 10-20 מ"ל). דגירה על מיקובקטריות פתוגניות ב-37 מעלות צלזיוס עם 20% O2 ו-5% CO2, ו-M. smegmatis ב-37 מעלות צלזיוס עם 20% O2.
- הגדר ניסוי בסגנון ריכוז מעכב מינימלי (MIC90) בתנאים של שכפול ואי-שכפול (איור 1).
הערה: סוכני בדיקה נבדקים בדרך כלל בכפילויות או בריבועים כדי לאפשר בדיקה של 4 או 2 תרכובות, בהתאמה, לכל מיקרו-צלחת של 96 בארות. לדוגמה, בצלחת של 96 בארות, ניתן לבחון חומר בדיקה אחד בשורות A-D ואחר בשורות E-H. ה-DMSO (רכב) נמצא בעמודות 1, 2 ו-12, וסדרת דילול חומרי הבדיקה עוברת מעמודה 3 (הריכוז הנמוך ביותר) לעמודה 11 (הריכוז הגבוה ביותר). בדיקות בסגנון MIC90 משתמשות בדרך כלל בסדרת דילול פי 2. ישנם מודלים רבים שאינם משתכפלים זמינים עבור מיקובקטריה, ולמטרות המחשה, אנו משתמשים במודל רב-מתח של אי-שכפול.
- לבדיקת השכפול, הפץ 200 מיקרוליטר תאים ב-7H9-ADN ב-OD580 של 0.01 לכל הבארות של צלחת 96 בארות עם תחתית שקופה, שטופלה בתרבית רקמות.
- עבור הבדיקה שאינה משכפלת, שטפו תאים פעמיים בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) המכילה 0.02% טילוקספול, והשעו מחדש תאים במדיום שאינו משכפל (0.05% KH2PO4, 0.05% MgSO4, 0.005% אמוניום ציטראט ברזל, 0.0001% ZnCl2, 0.1% NH4Cl, 0.5% BSA, 0.085% NaCl, 0.02% טילוקסאפול, 0.05% בוטיראט; pH מותאם ל-5.0 עם 2 N NaOH).
- לדלל תאים ל-OD580 של 0.1 בתווך שאינו משתכפל ולהוסיף NaNO2 ממלאי טרי של 1 M לריכוז סופי של 0.5 מילימטר.
- מחלקים 200 מיקרוליטר תאים ב-OD580 של 0.1 לכל הבארות של צלחת 96 בארות שקופה שטופלה בתרבית רקמה.
הערה: הכן דילולים מורכבים כתמיסות מלאי פי 100 ב-DMSO. לפיכך, לוחית MIC טיפוסית הבודקת את ההשפעה של מולקולה בריכוז סופי של 0.4-100 מיקרוגרם/מ"ל תדרוש תמיסות מלאי של 0.04-10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO.
- הוסף 2 מיקרוליטר של דילולים של חומר בדיקה 1 לשורות A-E ו-2 מיקרוליטר של דילולים של חומר בדיקה 2 לשורות E-H. מערבבים היטב.
- הוסף 2 מיקרוליטר בקרת רכב (בדרך כלל DMSO) לבארות בקרה, עמודות 1, 2, 12 (שורות A-H). מערבבים היטב.
- עבור כל ניסוי, כלול לפחות בקרה חיובית אחת כגון ריפמפיצין מ-0.004 עד 1 מיקרוגרם/מ"ל (בדיקת שכפול) ו/או 0.08 עד 20 מיקרוגרם/מ"ל (בדיקה שאינה משכפלת).
הערה: השימוש ב-6-bromo-1H-indazol-3-amine9 ב-0.1 עד 25 מיקרוגרם/מ"ל מומלץ כתרכובת בקרה בעלת פעילות סלקטיבית ותלויה ב-NaNO2 במודל הרב-מתח של אי-שכפול.
- לשכפול מבחנים, דגרו מיקרו-לוחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-20% O2 ו-5% CO2 למשך 7 ימים (M. tuberculosis ו-M. bovis BCG) או 1-48 שעות (M. smegmatis). עבור המודל הרב-מתחי של אי-שכפול, דגרו מיקרו-לוחות למשך 7 ימים ב-37 מעלות צלזיוס ב-1% O2 ו-5% CO2} (M. tuberculosis ו-M. bovis BCG).
2. חיסון של מיקרו-לוחות CARA
- בנקודות זמן שבהן ה-CARA ישמש כקריאה, השהה בזהירות את תכולת הבאר של לוחית הבדיקה בסגנון MIC90 באמצעות פיפטה רב-ערוצית p200 המוגדרת ב-50-75 מיקרוליטר. פיפטה למעלה ולמטה לפחות 5-10 פעמים וסובב בעדינות את תכולת הבאר בתנועה סיבובית באמצעות קצות הפיפטה.
- העבר 10 מיקרוליטר של תכולת באר הבדיקה למיקרו-צלחת CARA. ודא שסדר תכולת הבאר על לוחית הבדיקה תואם את סדר תכולת הבאר של המיקרו-צלחת של CARA. הימנע מהתזות במהלך ההעברות וודא ש-10 מיקרוליטר נצפו באמצע בארות המיקרו-פלטות של CARA. ודא ש-10 מיקרוליטר נספג במיקרו-צלחת CARA.
הערה: אין צורך בדילול לפני איתור תאים על לוחות המיקרו של CARA.
- קשרו ערימות של מיקרו-צלחות CARA עם סרט צלחת ולאחר מכן הניחו אותן בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת. דגירה של מיקרו-לוחות CARA ב-37 מעלות צלזיוס עם 20% O2 (M. smegmatis) או 1% O2 ו-5% CO2 (M. tuberculosis ו-M. bovis BCG).
- עבור M. tuberculosis ו- M. bovis BCG, שכפול מבחנים: דגירה למשך 7 ימים; עבור M. tuberculosis ו- M. bovis BCG בדיקות שאינן משכפלות, דגירה למשך 10 ימים; עבור M. smegmatis, שכפול בדיקות, דגירה למשך 1-2 ימים; עבור M. smegmatis, בדיקות שאינן משכפלות, דגירה 2-3 ימים.
הערה: הזמנים הם הערכות וניתן לשנות אותם בהתאם לתנאי שכפול, אי-שכפול ולחץ שונים.
3. פיתוח מיקרו-לוחות CARA
- פתח את המיקרו-לוחות של CARA כאשר סרט של גידול חיידקים, או מושבות מקרוסקופיות גדולות יותר, נראה על בארות הבקרה השליליות.
הערה: לאחר דגירה ממושכת, בארות המיקרו-פלטות של CARA נראות לעתים קרובות יבשות ואנו ממליצים להרטיב מראש את תכולת הבאר עם PBS סטרילי. זה משמש כדי למנוע מהפחם לספוג רזזורין, מה שעלול להוביל לפלואורסצנטיות נמוכה או לשונות באר לבאר.
- בעזרת סט יחיד של 12 קצות p200 עם פיפטה רב-ערוצית, הוציא 40 מיקרוליטר של PBS סטרילי לאורך צד הבארות ואפשר ל-PBS להתפזר על פני החלק העליון של המיקרו-מושבות האגר/חיידקים.
- הכן מגיב פיתוח CARA על ידי ערבוב של 5 מ"ג רזזורין (0.01% סופי) ו-50 מ"ל של 5% טווין-80 ב-PBS. מערבולת ומסנן סטרילי.
הערה: ניתן להכין מגיב חלופי לפיתוח CARA על ידי ערבוב תמיסה נוזלית של רזזורין שהוכנה מסחרית ב-1:1 (נפח/נפח) עם 10% Tween80 ב-PBS.
- הוסף 50 מיקרוליטר של ריאגנט פיתוח CARA טרי שהוכן לכל באר של המיקרו-פלטה של CARA באמצעות פיפטה בעלת 12 ערוצים. לוחות סלע קדימה ואחורה כמה פעמים כדי לסייע בהפצת ריאגנטים על פני האגר ומחצלת החיידקים בכל באר.
- יש להניח את הצלחות בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת ולדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עבור M. smegmatis ו-45-60 דקות עבור M. tuberculosis או M. bovis BCG.
הערה: אם בארות הבקרה של הרכב לא מצליחות להפוך לוורודות במהלך השעה הראשונה, ניתן לארוז מחדש את הלוחות ולדגור אותם לפרקי זמן ארוכים יותר.
- לפני קריאת הקרינה, הנח מיקרו-לוחות CARA במכסה מנוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כשמכסיהם מוסרים. בעת שימוש בספקטרופוטומטרים BSL3 מחוץ לארון בטיחות ביולוגית, הדביקו מדבקת PCR באיכות אופטית על הצלחת ואטמו היטב על ידי לחיצה עדינה על משטח המדבקה עם מגבת נייר רכה.
- קבע את הקרינה באמצעות קריאה עליונה עם עירור ב-530 ננומטר ופליטה ב-590 ננומטר. אין צורך לרוקן את הצלחת.
