1. הכנת מדיה ומגיבים
- הכן מדיה פיברובלסט. שלב 450 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ו -5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
- הכן כתב מקרופאגים גידול מדיה ב 50 מ"ל aliquots. שלב 45 מ"ל DMEM, 5 מ"ל FBS, 5 מיקרוגרם / מ"ל מגיב חיסול מיקופלסמה (טבלה של חומרים), ו 200 מיקרוגרם / מ"ל phleomycin D1 (טבלה של חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
- הכן כתב מקרופאגים assay מדיה ב 50 מ"ל aliquots. שלב 45 מ"ל של DMEM, 5 מ"ל של FBS (HI-FBS) מומתק חום, 5 מיקרוגרם / מ"ל מגיב חיסול מיקופלסמה, ו 200 מיקרוגרם / מ"ל phleomycin D1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
2. ציפוי משטחי תרבית תאים בפולי(מתיל מתקרילט)
- להמיס פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) בכלורופורם במינון של 20 מ"ג/מ"ל (למשל, 100 מ"ג PMMA ב-5 מ"ל כלורופורם) בבקבוקון זכוכית של 20 מ"ל. מניחים מוט ערבוב מגנטי בבקבוקון ומניחים לערבוב במשך שעתיים לפחות, עד שכל המוצקים נמסים.
זהירות: כלורופורם מזיק בשאיפה. הקפד להשתמש בממס במכסה אדים בעת לבישת כפפות PVA.
- פיפטה 400 מיקרוליטר של תמיסת PMMA על מרכז מיקרוסקופ זכוכית בורוסיליקט מחליקים בקואטר ספין, ומסתובבים במהירות 3000 סל"ד למשך 2 דקות. מכינים את מספר השקופיות הדרושות לבדיקה, וכן 3-5 נוספות למדידת זווית מגע עם מים. יש לאחסן שקופיות בקופסה נקייה (מרוססת ומנגבת באתנול 70%) לשימוש עתידי.
הערה: ציפוי ספין משמש לעתים קרובות להנחת ציפוי דק ואחיד על משטח שטוח. מעיל מסתובב מסובב מצע במהירויות גבוהות, תוך שימוש בכוח צנטריפוגלי כדי לפזר את תמיסת הציפוי על פני השטח.
- מדוד את זווית המגע עם המים בשני מיקומים אקראיים על פני השטח של שקופיות מצופות במיוחד (כלומר, לא המגלשות המשמשות לתרבית תאים) באמצעות גוניומטר כדי להבטיח שמשטח הזכוכית היה מצופה לחלוטין בפולימר.
הערה: יש להשתמש רק במים בעלי הטוהר הגבוה ביותר (למשל, זכוכית מזוקקת משולשת) למדידות זווית מגע עם מים.
- בארון בטיחות ביולוגי (BSC) חברו בארות דביקות בנות 8 תאים למגלשות מצופות PMMA באמצעות מלקחיים סטריליים ובהתאם לטכניקה האספטית. לחץ בחוזקה על החלק העליון של הבארות הדביקות כדי לוודא שהן מחוברות היטב. דגרו על המגלשות עם בארות דביקות מחוברות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאבטח את האטם.
- בדוק את האיטום של הבארות הדביקות על ידי הוספת 200 μL של מים בדרגת תרבית תאים (נטולי אנדוטוקסין) לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 60 דקות ולוודא שאין דליפה לפני שתמשיך. שאפו את המים, היזהרו שלא להפריע לציפוי PMMA.
- בצע שטיפות מים ללא אנדוטוקסין על ידי הוספת 300 μL של מים נטולי אנדוטוקסין לכל באר ודגרה במשך שעה אחת (שלוש פעמים), 12 שעות ו -24 שעות לפני השימוש כדי להסיר את כל הממס שנותר.
- בדוק את ריכוז האנדוטוקסין של המגלשות כדי לשמש לתרבית תאים. יש לדגור על 200 מיקרוליטר מים מגיבים נטולי אנדוטוקסין (טבלת חומרים) בבאר אחת מכל שקופית למשך שעה אחת. מדוד את ריכוז האנדוטוקסין בתמצית באמצעות בדיקת אנדוטוקסין כרומוגני בנקודת קצה (טבלה של חומרים).
הערה: הפרוטוקול הבא הוא ספציפי לערכת בדיקת האנדוטוקסין המופיעה בטבלת החומרים.
- השתמש רק במים ובחומרים מתכלים (כלומר, קצוות פיפטה, צינורות מיקרוצנטריפוגות וצלחות באר) המאושרים כנטולי פירוגן (כלומר, נטולי אנדוטוקסין) עבור עבודה זו. כמו כן, כל כלי זכוכית המשמש להכנת משטחים מצופים פולימר צריך להיות depyrogenated באמצעות עיקור בחום יבש (250 ° C במשך 30 דקות) לפני השימוש. מדידת אנדוטוקסין בתמיסת התמצית, כמתואר כאן, עלולה לגרום להערכת חסר של אנדוטוקסין על פני החומר. כתוצאה מכך, מומלץ כי בעת פיתוח פרוטוקול ציפוי פולימרי, לבצע את תגובת בדיקת האנדוטוקסין (כלומר, שלבים 2.6.4-2.6.6 עבור דגימות בדיקה [מים מגיבים] או בקרות ספייק) ישירות בתוך בארות המכילות את הדגימה המצופה כדי להבטיח שלא יוכנסו למערכת בשוגג מקורות אנדוטוקסין במהלך תהליך הציפוי.
- הביאו את כל דגימות הבדיקה (כלומר, תמציות) וריאגנטים לבדיקת אנדוטוקסין ל-RT. הרכיבו מחדש מגיב כרומוגני במאגר הבדיקה ובתקן אנדוטוקסין במים מגיבים, אפשרו להתמוסס במשך 5 דקות וערבלו בעדינות לפני השימוש. כסו את כל הבקבוקים בסרט פרפין כאשר אינם בשימוש.
- יצירת עקומת דילול סטנדרטית של 5-8 נקודות של תקן אנדוטוקסין החל מהגבול התחתון ועד העליון של הבדיקה על ידי ביצוע דילול סדרתי של תקן האנדוטוקסין במים מגיבים.
- כדי לשלוט לשיפור או עיכוב של בדיקת אנדוטוקסין בדגימות בדיקה, הכינו בקרה חיובית (הנקראת גם בקרת ספייק או דגימת ספייק) על ידי דילול כמות ידועה של אנדוטוקסין בתמיסת דגימת בדיקה שאינה בשימוש.
הערה: ריכוז הבקרה החיובית צריך להיות באותו ריכוז כמו תקן באמצע עקומת התקן. אם הכמות המשוחזרת של ספייק האנדוטוקסין (כלומר, ריכוז הבקרה החיובית פחות ריכוז דגימת הבדיקה הלא מעוגלת) נמצאת בטווח של 50-200% מהריכוז הנומינלי של ספייק האנדוטוקסין, ניתן לראות בתמיסת המיצוי ככזו שאינה מפריעה באופן משמעותי לבדיקה.
- הוסף 50 μL של תקנים, דוגמאות או פקדי ספייק לכל באר של צלחת 96 בארות כפולות או משולשות. השתמש במים מגיבים כבקרה שלילית.
- הוסף 50 μL של מגיב כרומוגני לכל באר. הוסף מגיב במהירות לכל הבארות. השתמש בטיימר כדי לתעד את משך הזמן שלוקח להוסיף מגיב לכל הבארות. מכסים את הצלחת באטם דבק ודגרים בטמפרטורה של 37°C (זמן הדגירה תלוי הרבה ומצוין בתעודת האנליזה הכלולה בערכת המגיב הכרומוגני). לחלופין, בדקו את הצלחת כל 15 דקות במהלך הדגירה עד שיבחינו בשינוי צבע בכל הבארות הסטנדרטיות.
- לאחר הדגירה, להוסיף 25 μL של 50% חומצה אצטית לכל באר (ריכוז סופי של 10% חומצה אצטית לכל באר) כדי לעצור את התגובה. הוסף חומצה אצטית באותו סדר כמו מגיב כרומוגני התווסף. קרא את ספיגת הצלחת באמצעות קורא לוחות ב- 405 ננומטר. לשאוף נוזל ולהשליך את הצלחת.
הערה: תוספת חומצה אצטית צריכה לקחת את אותו משך זמן להוסיף לכל באר כמו מגיב כרומוגני לקח (± 30 שניות).
- אולטרה סגול (UV) - לעקר את המגלשות במשך 30 דקות לפני ניסויים בתרבית תאים.
3. הכנת ליזט מתאים 3T3
- לגדל תאי 3T3 במספר צלוחיות T150 עד 70% מפגש. כדי לנתק תאים, לשאוף מדיה, לשטוף את פני השטח עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS), ולשאוף PBS. הוסיפו 5 מ"ל של אנזים דיסוציאציה תאי רקומביננטי (טבלת חומרים) ללא מקור מן החי ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות.
- נתקו תאים על ידי הטייה עדינה של הבקבוק קדימה ואחורה. הוסף 5 מ"ל של PBS כדי לנטרל את האנזים הרקומביננטי המשמש לדיסוציאציה של תאים. מעבירים את התאים המנותקים מהצלוחיות לצינור צנטריפוגה ומערבבים באמצעות פיפט. בצע ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer וצבע כדאיות התא.
הערה: אנזים דיסוציאציה של תאים שניתן לנטרל באמצעות דילול ב-PBS נבחר כדי למנוע הכנסת חלבונים מבוססי סרום להכנת הליזט. אם טריפסין משמש לניתוק תאים, יש לנטרל אותו עם תמיסה המכילה סרום, ויש לבצע שטיפת PBS נוספת כדי להפחית את כמות החלבונים בסרום המועברים לתוך הכנת הליזט.
- צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את תאי הסופרנאטנט והשהו מחדש בנפח המקורי (כלומר, 10 מ"ל x מספר צלוחיות) של PBS כדי לשטוף את כל המדיה שנותרה. חוזר.
- צנטריפוגו את התאים שוב ב 200 x גרם במשך 5 דקות ושאפו את supernatant. הוסף את נפח PBS הדרוש להשגת ריכוז תאים סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל. הכניסו את תמיסת התאים למקפיא בטמפרטורה של -80°C עד להקפאה מלאה של הדגימה (לפחות שעתיים).
- הפשיר תמיסת תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה המלאה, החזירו את התמיסה למקפיא בטמפרטורה של -80°C עד להקפאה מלאה. חזרו על הפעולה במשך 3 מחזורי הקפאה-הפשרה.
- בצע בדיקת חומצה מיקרו ביכונית (BCA) על התא ליזט במגוון דילולים (למשל, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) כדי לקבוע את ריכוז החלבון. לדלל את התא lysate לריכוז חלבון של 468.75 מיקרוגרם / מ"ל, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי.
הערה: ריכוז החלבון הסופי בצלחת בת 48 בארות הוא 125 מק"ג/סמ"ק2 (בהתבסס על שטח הפנים של באר אחת, 0.75 ס"מ2).
- בצע כתם מערבי כדי להעריך את נוכחותם של DAMPs בליזט (למשל, חלבון הלם חום 60 [HSP60], תיבה קבוצתית גבוהה ניידות 1 [HMGB1]) על ידי העמסת 40-60 מיקרוגרם של חלבון ליזט במאגר העמסה על ג'ל פוליאקרילאמיד בעובי 1.5 מ"מ בעובי 10% ופעל לפי נהלי כתם מערביים סטנדרטיים.
4. הערכת ההשפעה של שכבות חלבון נספג וקולטנים דמויי אגרה על פעילות NF-κB של מקרופאגים
הערה: לקבלת סכמה של תהליך העבודה הניסיוני ופריסת הלוחות, עיין באיור 1A ובאיור 2, בהתאמה.
- לגדל מקרופאגים מדווחים בבקבוק בגודל מתאים למפגש של 70%. שאפו מדיה, שטפו את פני השטח עם PBS ושאפו PBS. מוסיפים את אנזים הדיסוציאציה התאית הרקומביננטי ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 8 דקות.
- נתקו תאים על ידי הקשה חזקה על דפנות הצלוחית. נטרל את אנזים הדיסוציאציה של התא הרקומביננטי על ידי הוספת נפח שווה של מצע גדילה (המכיל 10% FBS). בצע ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer וצבע כדאיות התא.
הערה: הכדאיות הצפויה עבור המקרופאגים המדווחים לאחר דגירה של 8 דקות באנזים הדיסוציאציה התאית היא 90%.
- תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. שאפו סופרנאטנט והשהו מחדש בנפח המקורי של PBS כדי לשטוף תאים. צנטריפוגה שוב ולהשהות מחדש תאים ב 7.3 x 105 תאים / מ"ל במדיית בדיקה (המכילה FBS מומת חום).
- יש להפריד את תרחיף התאים ל-3 צינורות שונים: מעכב TLR4, נוגד TLR2 ולא מטופל. דגרו על תאים עם מעכב TLR4 1 מיקרוגרם/מ"ל למשך 60 דקות ב-RT או עם 50 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-TLR2 למשך 30 דקות ב-RT.
- הוסף 200 μL של ליזט, 10% FBS, 10% פלזמה עכבר מסחרית (טבלה של חומרים), או תערובת של תמיסות חלבון לצלחת 48 בארות (או שווה ערך) ולאפשר לחלבון לספוג ב 37 ° C למשך פרק הזמן הרצוי (כלומר, 30 דקות, 60 דקות, או 24 שעות). שאפו תמיסות חלבון מבארות, באמצעות פיפטה פסטר טרייה לכל תמיסת חלבון, ושטפו משטחים עם 250 מיקרוליטר PBS למשך 5 דקות. שאפו PBS. חזור על הפעולה במשך 3 כביסות בסך הכל.
הערה: ייתכן שיהיה צורך להתחיל שלב זה מוקדם יותר בפרוטוקול, בהתאם לזמן הספיחה הרצוי. התאם את הפרוטוקול בהתאם.
- לאחר תקופת הדגירה עם מעכב TLR4 או anti-TLR2, תאי פיפטה להשהיה מחדש. הוסף 200 μL של תמיסת תאים לכל באר.
- עבור מצב הבקרה החיובי TLR2, הוסף Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) לריכוז סופי של 150 ננוגרם/מ"ל. עבור מצב בקרה חיובי של TLR4, הוסף ליפופוליסכריד (LPS) לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 20 שעות.
- דגמו 20 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל באר וצלחת בשכפול לצלחת של 96 בארות. כלול שלוש בארות של מדיית בדיקה של 20 μL כבקרת רקע. הוסף 200 μL של מגיב בדיקת כתב SEAP לכל באר. מכסים את הצלחת באטם דבק ודגרים במשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 37°C.
הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי, ויש למטב אותו להבדל חזק בספיגה בין בארות בקרה חיוביות ושליליות.
- מעבירים את שארית הסופרנאטנט לצינור של 1.5 מ"ל (לכל באר). צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להשליך כל פסולת. העבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C. נתחו סופרנאטנט לנוכחות ציטוקינים מעודדי דלקת (למשל, גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), אינטרלוקין 6) באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA).
- הסירו את אטם צלחת ההדבקה. קרא את ספיגת הצלחת באמצעות קורא לוחות ב- 635 ננומטר. לשאוף נוזל ולהשליך את הצלחת.
