1. דור של lentivirus קידוד CAR
הערה: לאחר השלמת בניית הפלסמיד הספציפי של קולטן האנטיגן הכימרי (CAR) T-cell (CD47 ואחרים), מכוניות לנטי-ויראליות נוצרות על ידי ההליך הסטנדרטי, באמצעות תאי 293 FT, תערובת אריזה לנטיויראלית וסוכני טרנספקציה (ראה טבלת חומרים) כמתואר. לאחר מכן, השתמש בערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (RT-PCR) ובמחזור תרמי (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את טיטר הנגיף על ידי מדידת כמות ה- RNA הלנטיוויראלי בהתאם לפרוטוקול היצרן. חשוב כי כל ההליכים lentiviral להתבצע בקפידה בעקבות דרישות הבטיחות.
- זרעו 15 x 106 תאי HEK293FT בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), ודגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בצלחת אחת של 150 מ"מ בתוך אינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני (CO2).
- הכינו שני צינורות 15 מ"ל עם קומפלקס טרנספקציה. הצינור הראשון מכיל DNA פלסמיד וקטורי לנטיויראלי (5 מיקרוגרם) ותערובת אריזה לנטיויראלית (22.5 מיקרוגרם) ב-2.5 מ"ל של תמיסת דילול טרנספקציה. הצינור השני מכיל 82.5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ב 2.5 מ"ל של תמיסת דילול טרנספקציה (ראה טבלת חומרים).
- הכניסו את תכולת צינור 1 לצינור 2, ודגרו על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- מעבירים את תכולת הצינור בטיפה לצלחת של HEK293FT התאים ודגרו על הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני, CO2.
- למחרת, להחליף את המדיום הקיים עם 19 מ"ל של מדיום תרבית DMEM טרי ולהמשיך לדגור את התאים במשך הלילה בתוך אינקובטור 5% CO2 לח ב 37 ° C.
- מעבירים את המדיום מהצלחת לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. שמור את הצינור עם המדיום המכיל וירוס במקרר.
- חזור על ההליך לעיל, הוספת DMEM טרי ואיסוף אותו שוב לאחר יום אחד.
- שלב שני אוספים של המדיה לתוך צינור צנטריפוגה אחד. צנטריפוגט את הצינור ב 2,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את רוב הסופרנאטנט המכיל לנטיוירוס לצינור צנטריפוגה אולטרה-שקוף. השאירו נפח מינימלי, כ-1 מ"ל של הסופרנאטנט כדי למנוע הפרעה לכדורייה שעלולה להכיל תאים ו/או פסולת.
- אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט שהובהר לעיל ב 110,000 x גרם במשך 100 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant בזהירות להוסיף בעדינות 100 μL של מדיום DMEM לגלולת וירוס בתחתית הצינור. השאירו את הצינור על קרח למשך 15 דקות. מערבבים את התמיסה בעדינות ומוסיפים את תמיסת הלנטיוירוס לצינורות סטריליים מצוננים. אחסנו את שפופרות מלאי הווירוסים האלה במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
- השתמש בערכת RT-PCR כמותית כדי לקבוע את titer של lentivirus על פי פרוטוקול היצרן, אשר מחלץ ומודד RNA lentiviral.
2. יצירה והרחבה של תאי CAR T
- הפעל תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים שהוקפאו בעבר (PBMCs) (בערך 1 x 10,6 עד 2 x 10,6 תאים) ב 1 מ"ל של תווך תאי T CAR עם מספר שווה של מיקרו-כדוריות מצופות CD3 / CD28 (ראה טבלת חומרים) ודגור על התאים ב -37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 במשך 24 שעות.
- הפשיר aliquot של מלאי lentivirus על קרח.
- מוסיפים 1 μL של חומר משפר התמרה לתוך הבאר עם התאים ומערבבים.
- הוסף lentivirus לתאים בריבוי של זיהום (MOI) של 5: 1 וערבב בעדינות. למחרת, חזור על שלב זה (24 שעות לאחר ההתמרה הראשונה).
- עקוב אחר צמיחת תאי T כל 2-3 ימים. הוסף עוד תווך טרי של תאי T CAR כדי לשמור על התאים בצפיפות של 1 x 106 עד 2 x 106 תאים / מ"ל.
- הקפיאו את תאי CAR T באמצעות פרוטוקול סטנדרטי באמצעות תמיסת הקפאה (ראו טבלת חומרים).
- הפשירו תאי CAR T בשיטה סטנדרטית והתרבו אותם בתווך תאי T CAR במשך כ~2-4 שעות עם אינטרלוקין-2, IL-2 (300 יחידות / מ"ל) לפני החלתם על הבדיקה.
3. זיהוי ביטוי CAR על ידי ציטומטריית זרימה
- העבר 3 x 105 תאי CAR T ותאי T לא מותמרים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם למשך 2 דקות ולהשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) המכיל 1% סרום אנושי.
- יש לפזר 100 μL של תמיסת תאים לשני צינורות FACS פוליסטירן 5 מ"ל ולשמור את הצינורות על קרח למשך 5 דקות.
- הוסף 1 μL של עז אנטי-עכבר ביוטינילציה F(ab')2 לצינור אחד מכל סוג תא. לאחר מכן, הוסף 2 μL של phycoerythrin, נוגדן אנטי-תג המסומן PE (ראה טבלת חומרים) לצינור השני של כל סוג תא. מערבבים היטב ודגרים על קרח במשך 30 דקות.
- שטפו את התאים עם 3 מ"ל של חיץ FACS בכל צינור וצנטריפוגו את הצינורות ב 300 x גרם במשך 5 דקות; השליכו את הסופרנאטנטים והמערבולות לזמן קצר מאוד או נערו את הצינורות לזמן קצר כדי להשהות מחדש את התאים בנוזל השיורי.
- הוסף 2 μL של תאים מציגי אנטיגן (APC) anti-CD3 ו -2 μL של תמיסת נוגדנים 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (ראה טבלת חומרים) לכל צינור. בצינור של תאים מוכתמים עם anti-F(ab')2 Ab, להוסיף 1 μL של streptavidin-labeled PE. מערבבים לזמן קצר ודוגרים על הצינורות על קרח למשך 30 דקות נוספות.
- השתמש במאגר FACS כדי לשטוף שוב את התאים כמתואר בשלב 3.5 והוסף מאגר FACS נוסף של 200 μL לכל צינור.
- השתמש בציטומטריית זרימה כדי לנתח את התאים על ידי תחילה gating על תאי T בתרשים פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי ולאחר מכן gating על התאים החיים (7-AAD-שלילי) בתרשים CD3 לעומת 7-AAD. השלב האחרון הוא לנתח אנטי-תג, אנטי-ScFv או אנטי-F(ab')2 לעומת CD3.
4. בדיקת עוצמת ציטוליזה בזמן אמת (RTCA)
הערה: בצע את בדיקת RTCA בהתאם לתנאים המומלצים של היצרן. בקצרה, תחילה לוחית את תאי המטרה בבארות של לוח E, ולאחר מכן תוספת של תאי CAR T למחרת. פעילות הציטוליזה של תאי CAR T כנגד תאי המטרה מנוטרת בזמן אמת. תאי T ותאי T מומרים מדומים (תאי T מסוג Mock CAR) משמשים כבקרות של תאי השפעה שלילית. הפרוטוקול הבא מתאר בדיקת עוצמת ציטוליזה בזמן אמת במבחנה עבור שורות תאי גידול דבקים.
- הוסף 100 μL של מדיום תרבית תאי מטרה לכל באר של xCELLigence E-Plate, מקם את הצלחת בתוך מכשיר xCELLigence ובצע קריאת רקע. לאחר מכן, העבירו את צלחת ה-E למכסה מנוע של תרבית רקמה לצורך זריעת תאים.
- השתמש בפרוטוקול סטנדרטי כדי טריפסיניזציה של תאי סרטן מטרה ממכשיר התרבית. לאחר מכן להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולהוסיף מדיום תרבית טרי, עד 15 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 5 מ"ל של מדיום טרי, והשתמשו בפיפט סרולוגי כדי להשהות מחדש בעדינות את כדורית התא. ספרו את צפיפות התאים החיים באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ.
- כוונן את צפיפות התא בהתאם ולאחר מכן הוסף 100 ליטר של תרחיף התא לכל באר של לוח ה- E. מספר תאי היעד הוא בדרך כלל סביב 10,000 תאים/באר עבור שורות תאים דבקים (BxPC3, Hela-CD19 ו-SKOV3), או 30,000 תאים/באר עבור תאים מתרחפים כגון ראג'י (ראה בהמשך פרטים לגבי ציפוי בארות בנוגדנים על מנת לקשור תאים סרטניים נוזליים).
- אזנו את צלחת ה-E בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה בתחתית הבאר (זה קריטי; אל תדלגו על שלב זה).
- הכניסו את ה-E-Plate למכשיר xCELLigence בתוך אינקובטור תרביות התאים והתחילו למדוד עכבה, המוצגת כאינדקס תאים לעומת זמן, באופן אוטומטי כל 15 דקות.
- למחרת, הכינו תאי CAR T משפיעים. הקפד להכין בקרות מתאימות (כלומר, תאי CAR T מדומים, תאי T בקרה שאינם מותמרים ו / או תאי CAR T שאינם קשורים) מראש כדי להבטיח שכל התאים מוכנים בו זמנית. התאימו את תאי האפקט ואת תאי הבקרה לצפיפות הנכונה, והכינו דילולים טוריים כדי להבטיח את יחסי ה- E:T הרצויים יושגו כאשר 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי אפקט יתווסף לכל באר בשלב 9.
- השהה את איסוף הנתונים של xCELLigence והבא את ה- E-Plate מהחממה למכסה מנוע של תרבית תאים.
- מוציאים 100 מיקרוליטר מדיום מכל באר. כמות המדיום השיורי בכל באר היא כעת 100 μL.
- הוסף 100 μL של תאי CAR T בעלי השפעה בדילול סדרתי או תאי בקרה אחרים (כלומר תאי CAR T מדומים) כדי להשיג את יחסי E:T הרצויים.
- אזנו את לוח ה-E בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאי האפקט לשקוע, ולאחר מכן הניחו את לוח ה-E בחזרה במכשיר xCELLigence. חידוש איסוף נתונים.
- אם תרצה בכך, בנקודות זמן מרכזיות ניתן להשהות את איסוף נתוני xCELLigence ולהסיר את הצלחת על מנת לאסוף דגימות קטנות לניתוח על ידי בדיקות אורתוגונליות (כלומר, מדידת ייצור ציטוקינים על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) או ציטומטריית זרימה).
- בניסוי תאי T לרכב EGFR-GITR-CD3, מדדו תפוקת אינטרפרון-גמא (IFNγ) באמצעות ערכת ELISA (פעלו בהתאם להוראות היצרן; ראו טבלת חומרים).
הערה לגבי השימוש בסרטן נוזלי: לבדיקת תאים סרטניים המטולוגיים שאינם דבקים, לפני הוספת תאים בארות צלחת ה- E מצופות תחילה בנוגדן ספציפי לאנטיגן המתבטא על פני התאים הסרטניים. עבור קו התאים Raji B, מגיב קשירה המבוסס על אנטי CD40 משמש (ראה ערכת בדיקה להרוג גידול נוזלי בטבלת החומרים). להלן הליך ציפוי הצלחת:
- לדלל את מגיב הקשירה (anti-CD40) עם מאגר קשירה לריכוז של 4 מיקרוגרם / מ"ל.
- בעבודה בתוך מכסה מנוע של תרבית רקמה, הוסף 50 μL של מגיב הקשירה המדולל לכל באר של צלחת E. השאירו את צלחת ה-E בטמפרטורת החדר או באינקובטור של 37°C למשך 3 שעות.
- הסר את מגיב הקשירה ושטוף את צלחת ה- E לפחות פעמיים עם מאגר שטיפה. בשלב זה, לוח ה-E מוכן לזריעת תאי המטרה של ראג'י (30,000 תאים/באר).
- המשך לשלב 4.1 (לעיל) כדי לבצע את שאר ההליך.
