1. הכנת המדיה והפתרונות
- הכינו את מדיום התרבית: RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), pH 7.4.
- הכן מדיום תרבית בדיקה: RPMI-1640 ללא פנול אדום אבל עם 1% FBS, pH 7.4.
- הכן תמיסת שטיפת תאים: תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) ללא מ"ג ו-Ca של Dulbecco עם 0.02% EDTA, pH 7.4.
- הכן תמיסת ניתוק תאים: 0.125% טריפסין עם 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA).
- הפשיר 100 מ"ל של תמיסה 0.25% של טריפסין-EDTA ולהעביר לצלוחית סטרילית של 500 מ"ל.
- מערבבים עם 100 מ"ל של תמיסת שטיפת תאים ומחלקים 15 מ"ל aliquots לתוך 15 מ"ל צינורות סטריליים. יש לאחסן בטמפרטורה של -70 עד -80°C עד לשימוש.
- סננו תמיסות אלה דרך קרום של 0.22 מיקרומטר וחממו עד 37°C במשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
- הכינו תמיסת מלאי אפופטוזיס-אינדוקציה תמיסת TNFα ב 3.3 מיקרוגרם / מ"ל.
- יש להמיס 20 מיקרוגרם TNFα עם 500 מיקרוליטר מים מעוקרים במיכל הראשי ולערבב עד להמסה מלאה.
- מעבירים לצינור סטרילי של 15 מ"ל ומוסיפים 5.5 מ"ל של תמיסה DPBS ללא מ"ג ו-Ca לצינור זה. מערבבים בעדינות באמצעות מערבל מערבולת.
- Aliquot את הפתרון לתוך 70 μL מנות. מוציאים כל aliquot לתוך microtubes 0.5 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C.
- הכינו תמיסת אינדוקציה אפופטוזיס: תמיסת TNFα ב-40 ננוגרם/מ"ל.
- הפשיר aliquot של תמיסת מלאי אינדוקציה אפופטוזיס, לדגור אותו באמבט מים ב 25 ° C במשך 10 דקות.
- דללו את תמיסת מלאי ההשראה של אפופטוזיס ל-40 ננוגרם/מ"ל על ידי הוספת 61 מיקרוליטר של תמיסת TNFα של 3.3 מיקרוגרם/מ"ל ל-4.939 מ"ל של מדיום תרבית בדיקה בצינור סטרילי של 15 מ"ל.
- מערבבים עם מערבל מערבולת במשך 10 שניות; יש להכין תמיסה טרייה לפני השימוש.
- יש לחמם את התמיסה ל-37°C למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש בבדיקת הנטרול.
- הכינו את תמיסת המצע: תמיסת קספז 3/7 גלו.
- הפשירו את תמיסת חיץ הקספז (קספז 3/7 חיץ גלו) למשך 12 שעות לפני השימוש.
- תן לתמיסת חיץ הקספז ולמצע (מצע קספז 3/7 גלו) לשבת בנפרד ב 25 ± 5 ° C במשך 30 דקות לפני הערבוב.
- מעבירים 10 מ"ל מתמיסת חיץ הקספז לבקבוקון המצע ומערבבים בהיפוך.
- יש לשמור על טמפרטורה של 25 ± 5°C, מוגן מפני אור עד לשימוש.
הערה: הפתרון יציב במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר.
2. תרבית תאים וספירה
- הפשרת תאים ותת-התרבות הראשונה.
- הוציאו בקבוקון אחד עם תאי WEHI 164 מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והעבירו אותם לאמבט קרח.
- פיפטה למעלה ולמטה עם 1 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש עד שהתאים הקפואים מפשירים לחלוטין.
- יש לפזר 9 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש על צינור סטרילי של 15 מ"ל.
- מעבירים את תרחיף התא לתוך הצינור הסטרילי בנפח 15 מ"ל ומערבבים בעדינות חמש פעמים בהיפוך.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 125 x גרם במשך 3 דקות. להשליך את supernatant ו לפרק את גלולת התא.
- הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבית לצינור. מערבבים עד שהתאים מושהים לחלוטין.
- לספירת תאים, העבירו 50 μL של תרחיף התא למיקרו-צינורית של 500 μL וערבבו עם 50 μL של 0.4% טריפאן כחול. ספור את התאים והתאם אותם ל- 0.5 x 106 תאים/מ"ל. ראה שלב 2.2, להלן.
- הוסף 13 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש לצלוחית תרבית תאים של 75 מ"ל.
- יש להוציא מספיק נפח תרחיף תאים משלב 2.1.6 כדי להשיג 0.5 x 106 תאים/מ"ל בבקבוק תרבית התאים ולדגור ב-37°C ו-5% CO2 למשך הלילה.
- ספירת תאים.
- באמצעות הפתרון משלב 2.1.6, להעביר 0.05 מ"ל להמוציטומטר ולקבוע את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ באמצעות הדרה כחול טריפאן.
- כמת את המספר הכולל של תאים ותאים בני קיימא.
- כוונן את מתלי התאים ל- 0.5 x 106 תאים/mL.
V culture medium(mL) = 
V תרבית בינונית (מ"ל) = (5mL -השעיית תא V)
V תרבית בינונית (מ"ל) = נפח מותאם של WEHI 164 תא השעיה
NVC = מספר תאי WEHI 164 קיימא/mL
Vתרבית בינונית (mL) = נפח בינוני של תרבית Assay נוסף לתרחיף התא כדי להשיג 0.5 x 106 תאים/mL
0.5 x 106 = צפיפות תאי יעד
- ניתוק תאים ותת-התרביות השנייה והשלישית.
הערה: ניתן להשתמש במערכת ואקום כדי להסיר את התמיסות מהצלוחיות. ניתן להשתמש בפיפטות חד פעמיות או זכוכית סטרילית. אם לפיפטה יש סתימת כותנה בחלק העליון, יש להסיר אותה לפני השימוש.
- מוציאים את מדיום התרבית מבקבוק T של תרבית התא באמצעות פיפטה סטרילית של 1 מ"ל ואקום.
- יש להוציא 5 מ"ל של תמיסת שטיפת תאים לתוך תרבית T-flask, לערבב בעדינות, ולהשליך את התמיסה. חזור על שלב זה פעמיים.
הערה: הסרה מלאה של מדיום התרבית היא קריטית לניתוק תאים יעיל.
- הוסף 15 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לבקבוק T ותן לעמוד במשך 3 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
- ודא את היעדר התאים המחוברים בדופן הפנימית של הצלוחית מתחת למיקרוסקופ. מוציאים את התאים מבקבוק T בתרבית באמצעות פיפטה סטרילית של 20 מ"ל ומחלקים אותם לצינור סטרילי של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 125 x גרם במשך 3 דקות. להשליך את supernatant ו resuspend את הגלולה עם עוד 5 מ"ל של מדיום תרבית.
- ספרו את התאים והוסיפו מספיק מדיום תרבית כדי להגיע לריכוז התאים הרצוי לפי משוואה 1.
- הוסיפו את התרחיף הזה לבקבוק Tבקוטר 72 ס"מ ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- תרבית משנה של התאים לפחות פעמיים לפני השימוש בהם בבדיקת הניטרול. חזור על שלבים 2.3.1-2.3.8 ביומיים הבאים.
- השעיית תא Assay.
- בחר תת-תרבות WEHI 164 שיש לה לפחות שלושה מעברים. ראה שלב 2.1.
- נתק וספור את התאים לפי שלבים 2.2 ו-2.3 של פרוטוקול זה.
- לדלל את תרחיף התא בהתאם למשוואה 1 עד 0.5 x 106 תאים/מ"ל.
- השתמש בתרחיף סלולרי זה לבדיקת הנטרול. ערבבו את כל מתלי התאים עם מערבל מערבולת לפני השימוש.
3. הכנת נוגדנים ודילול
- כימות של mAbs.
- קבע את ריכוז חומר הייחוס, דגימת הבקרה והדגימה האנליטית באמצעות ספיגת UV ב- 280 ננומטר באמצעות מקדם ההכחדה ההמונית שלהם (1.39).
הערה: ריכוזים מקוריים יכולים להילקח מתוויות מוצרי תרופות. עם זאת, יש לאמת זאת על ידי ספיגת UV.
- דילולי mAb.
- יש לדלל את כל הדגימות באופן עצמאי בטריפליקט, עם תמיסה נטולת DPBS מ"ג ו-Ca במיקרו-צינוריות של 2 מ"ל, עד 2 מ"ג/מ"ל. אשר ריכוז זה על ידי ספיגת UV בטריפליקט, תוך שימוש בתמיסה נטולת DPBS Mg ו- Ca כחסר.
- ערבבו את תמיסות החלבון במשך 5 שניות באמצעות מערבל מערבולת.
- לדלל 100 μL של כל 2 מ"ג / מ"ל mAb פתרון עם 0.9 מ"ל של מדיום תרבית המבחן.
- מערבבים במשך 5 שניות עם מערבל מערבולת.
הערה: לתמיסות אלה יש ריכוז של 200 מיקרוגרם / מ"ל. יש לבצע דילולים עבור כל משולש.
- לדלל 10 μL של כל 200 מיקרוגרם / mL mAb פתרון עם 0.99 מ"ל של מדיום תרבית המבחן. מערבבים במשך 5 שניות באמצעות מערבל מערבולת. לתמיסות אלה יש ריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל. בצע דילול סדרתי עבור כל טריפליקט לפני השימוש בהם בבדיקת הנטרול.
- הכינו דילולים נגד TNFα mAb בשלוש צלחות מיקרו עצמאיות. בצע שכפול מכל שלשה עצמאית וחלק אותם במיקרו-צלחת אחת, כפי שמצוין בטבלה 1. חומר ייחוס
- בצע דילול mAb של כל הפניה, דגימה או פקד, כפי שמוצג בטבלה 2.
הערה: ריכוזי נוגדי TNFα mAb המתוארים בטבלה זו אינם הריכוזים הסופיים בבדיקת הניטרול.
- שמור את הצלחות על 25 ± 5 ° C עד לשימוש.
4. בדיקת נטרול עם WEHI 164 תאים
- יש לערבב על ידי ערבול כל מתלי התאים (0.5 x 10,6 תאים/מ"ל) לפני ניפוק בכל שלב של פרוטוקול זה.
הערה: בחלק זה, חממו כל תמיסה ל-37°C למשך 30 דקות לפני השימוש.
- מעבירים 50 μL של תרחיף התא לכל אחת מ-60 הבארות של המיקרו-צלחות, עוברים מטור 2 ל-11 וקו B ל-G.
- העבר 50 μL של ייחוס mAb, דגימה ודילול בקרה לתוך microplates. עקבו אחר התבנית המתוארת באיור 1.
- הוסף 50 μL של תמיסת אינדוקציה אפופטוזיס לכל באר.
- השתמש בבקרות תאיות של 50 μL של תאי WEHI 164, המחולקים בשלוש בארות. הביאו כל באר לנפח סופי של 150 μL עם מדיום תרבית בדיקה.
- השתמש בקרת ציטוטוקסיות של תערובת של 50 μL של WEHI 164 תאים בתוספת 50 μL של תמיסת אינדוקציה אפופטוזיס. הביאו כל באר לנפח סופי של 150 μL עם מדיום תרבית בדיקה.
- עבור בקרת TNFα, השתמש ב- 50 μL של תמיסת השראת אפופטוזיס והבא אותה ל- 150 μL עם מדיום תרבית הבדיקה.
- עבור החסר, השתמש 150 μL של מדיום תרבות הבדיקה בלבד.
- מלא את הבארות הנותרות עם 150 μL של מדיום תרבית כדי למנוע השפעות אידוי צלחות.
- חזור על שלבים 4.1.1-4.1.9 פעמיים בשתי מיקרו-צלחות אחרות.
הערה: הריכוזים הסופיים של mAb במיקרו-צלחת הם: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ו-0.004 מיקרוגרם/מ"ל.
- טען את הדגימות במיקרו-צלחות, כפי שמצוין באיור 1
- לדגור את שלושת הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 16 ± 2 שעות.
- תן caspase 3/7 Glo מגיב לעמוד על 25 ± 5 ° C במשך 30 דקות לפני השימוש.
- הוסף 100 μL של מגיב זה לכל הבארות, כולל הדגימות והפקדים.
- נערו את הצלחות באמצעות מערבולת מיקרו-צלחות במשך 3 דקות בטמפרטורה של 25 ±-5 מעלות צלזיוס מיד לאחר הניפוק לבארות.
- לדגור את הצלחות במשך 2.5 ± 0.5 שעות ב 25 ± 5 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
- הכנס את המיקרו-צלחות ללומנומטר והשלם את החלק הבא.
5. ניתוח התוצאות
- באמצעות תוכנה לזיהוי עוצמת אור, בחר את מצב ההארה ואת פונקציית נקודת הקצה.
- בחר לוח תחתון שקוף של 96 בארות ואת 80 הבארות הפנימיות שלו, למעט עמודות 1 ו -12.
- בחר זמן שילוב של 1,250 אלפיות השנייה ו- 10 שניות לערבוב לוח המיקרו לפני הקריאה.
- בחר את הבארות שבהן יוצבו חומר הייחוס, החומר האנליטי ודגימת הבקרה וזהה אותם עם ריכוזיהם המתאימים.
- קרא את הדגימות שהונחו בלוחות המיקרו עם הלומינומטר.
- השתמש במשוואת פרמטר רביעי לניתוח התוצאות. שרטט עקומת מנה-תגובה, כפי שהיא מתוארת באיור 2.
הערה: במשוואת הפרמטר הרביעי, C הוא הריכוז האפקטיבי 50 (EC50). ערך זה ישמש להשוואת חומר הייחוס, הדגימה האנליטית ודגימת הבקרה באמצעות פונקציית המשפיע.
- לחישוב העוצמות היחסיות, קבע את חומר הייחוס ל -100% חשב את עוצמות הדגימה, ובקר בהתאם.
הערה: הערכים האלה מתוארים באיור 3.
טבלה 1: מערכים לדוגמה של Microplate. בדיקת נטרול מלאה חייבת להתבצע בשלושה מיקרו-לוחות בתוך קואורדינטות B2 עד G11. חלוקה אקראית של דגימות ייחוס, ניתוח ובקרה מאפשרת לחוקרים לאמת כל הטיה בבדיקה.
| Plate 1 | Plate 2 | צלחת 3 |
| וולס | לדוגמה | וולס | לדוגמה | וולס | לדוגמה |
| B2:B11 | חומר ייחוס | B2:B11 | Control Sample | B2:B11 | Analytical Sample |
| ג2:ג11 | ג2:ג11 | ג2:ג11 |
| ד2:ד11 | Analytical Sample | ד2:ד11 | חומר ייחוס | ד2:ד11 | Control Sample |
| ה2:ה11 | ה2:ה11 | ה2:ה11 |
| F2:F11 | Control Sample | F2:F11 | Analytical Sample | F2:F11 | חומר ייחוס |
| G2:G11 | G2:G11 | G2:G11 |
טבלה 2: דילול mAb נגד TNFα. דילולים סדרתיים של mAbs נגד TNFα מודגמים בטבלה זו. הריכוזים הסופיים המתוארים בטבלה זו אינם הריכוזים בבדיקה, שבה mAbs אנטי-TNFα דוללו פי 3 (דילול mAb + מדיום תרבית + תרחיף תאים). קווים מודגשים מייצגים דילולים המגיעים מקווים 3, 5, 7, 9 ו- 10; קווים לא מודגשים מייצגים דילול מקווים 3, 4 ו-6. דילולים סדרתיים אלה נעשים ממש לפני ביצוע בדיקת הנטרול. יש להקפיד לערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים לפני חלוקת הדילול.
| עמוד צלחת | נפח מדיום תרבות Assay (μL) | נפח חומר ייחוס, מדגם אנליטי או דגימת בקרה (uL) | ריכוז בצלחת הבדיקה (ng/mL) |
| 2 | 0 | 230 | 2000 |
| 3 | 150 | 150 מקו 2 | 1000 |
| 4 | 75 | 75 מקו 3 | 500 |
| 5 | 100 | 50 מקו 3 | 333 |
| 6 | 75 | 75 מקו 4 | 250 |
| 7 | 75 | 75 מקו 5 | 166 |
| 8 | 75 | 75 מקו 6 | 125 |
| 9 | 75 | 75 מקו 7 | 83 |
| 10 | 75 | 75 מקו 9 | 41 |
| 11 | 150 | 75 מקו 10 | 13 |
