בדיקת תאים דנדריטיים בפולסים במבחנה המבוססת על חיסון כדי לגרום לשגשוג לימפוציטים

תקציר

מקור: Liaqat, F., et al., קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר. J. Vis. Exp. (195), (2023).

סרטון זה מדגים תא דנדריטי שמקורו במונוציטים, בדיקה מבוססת MoDC למדידת האימונוגניות של חיסונים זמינים מסחרית. מבחני MoDC חוקרים תגובות תאים דנדריטיים לאנטיגנים, פתוגנים או טיפולים ויכולים לספק תובנות לגבי תגובות חיסוניות, פיתוח חיסונים ומחקר אימונותרפיה.

פרוטוקול

1. ייצור משרדי ממשלה נאיביים

הערה: דגימות דם שלמות התקבלו מעגל יחיד ללא פתוגן על ידי ניקוב ורידים ג'וגולרי עם vacutainers heparinized (שמונה צינורות דם 9 מ"ל שימשו במחקר זה). העבירו את הדם בקופסת קרח. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או עבדו אותן מיד. שמור על הדם מסתובב כדי למנוע קרישת דם. לעקר את vacutainers עם 70% אתנול. כל הניסויים הבאים בוצעו עם דגימה ביולוגית אחת ושישה שכפולים טכניים.

1. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות לבידוד PBMCs מהדם הפריניזציה
   1. מערבבים היטב את הדם על ידי הפיכתו פי 10.
   2. באמצעות פיפטה 10 מ"ל, להעביר 20 מ"ל של דם heparinized לצינור סטרילי 50 מ"ל, ולדלל אותו עם 10 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS).
   3. פיפטה 15 מ"ל של בידוד לימפוציטים בינוני לצינור סטרילי 50 מ"ל.
      הערה: יש לאפשר למדיום המבודד לימפוציטים להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפיפט.
   4. הטה את צינור 50 מ"ל המכיל את מדיום בידוד הלימפוציטים למצב של 45°. הצבע על קצה פיפטה 25 מ"ל בניצב, ושכב בזהירות את 30 מ"ל הדם PBS על גבי מדיום בידוד הלימפוציטים, מבלי לערבב את השניים. לאט מאוד, להחזיר את הצינור 50 מ"ל למצב אנכי.
   5. צנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 35 דקות ב-20°C עם האצה מרבית וללא בלימה (פונקציית ההאטה כבויה).
   6. השתמש פיפטה פסטר לאסוף את שכבת PBMC (השכבה הלבנה הדקה מיד אחרי השכבה הראשונה של פלזמה) ולהעביר אותו לתוך צינור חדש 50 מ"ל.
      הערה: צנטריפוגת שיפוע צפיפות מפרידה דם שלם לשכבות שונות. כתוצאה מכך, אריתרוציטים להתיישב בתחתית כמו גלולה, תאים mononuclear (PBMCs) להתיישב בשכבת הממשק, ואת פלזמה יוצר את השכבה העליונה. גרנולוציטים נמצאים בין הגלולה לבין שכבת PBMC.
   7. שטפו את מרכזיות הקטיף פי 2 על ידי הוספת PBS עד לנפח של 40 מ"ל וערבוב יסודי על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 × גרם ב 4 ° C במשך 7 דקות עם תאוצה מקסימלית האטה מקסימלית.
   8. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי דקנטציה, להשהות מחדש את הגלולה ב-15 מ"ל של חיץ אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) אחד, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
      הערה: אין לדגור במשך יותר מ-15 דקות. מאגר ACK זמין מסחרית משמש כדי להבטיח את הליזה של תאי הדם האדומים שיורית (RBCs) נוכח בחלק PBMC.
   9. הוסף PBS לנפח של 40 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם ו 4 ° C במשך 7 דקות עם האצה והאטה מרביות.
   10. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, וחזרו על שלב 1.1.9.
   11. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיום תרבית שלם (בטמפרטורת החדר).
       הערה: מדיום התרבית המלא מורכב ממדיום תרבית תאים RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. הפרדה מגנטית של תאי CD14^+/− מאוכלוסיית PBMC באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים CD14
   1. ספור את התאים עם מונה תאי המוציטומטר נקי באמצעות 10 μL של תרחיף תאים מעורבב עם 10 μL של תמיסת טריפאן כחול (0.4%) .
      הערה: צבע כחול טריפאן הוא כימיקל רעיל ומסרטן פוטנציאלי. יש לטפל בו בעת לבישת ציוד מגן אישי (PPE) כדי למנוע מגע, ויש להשליך את הפסולת במיכל אטום מיוחד לפסולת רעילה. תאים מתים ייראו כחולים, ואילו תאים חיים ייראו צלולים מתחת למיקרוסקופ.
   2. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
   3. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, והשהו מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות נפח של 40 μL לכל 1 × 10⁷ תאים. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
      הערה: מאגר FACS מורכב מ-2% FBS ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) המומסים ב-PBS.
   4. הוסף 5 μL של CD14 microbead buffer לכל 1 × 10⁷ תאים, וערבב היטב באמצעות פיפטה.
   5. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס לבחירה חיובית של מונוציטים ^CD14+ בקר. מערבולת כל 15 דקות במהלך תקופת הדגירה.
   6. שלב אופציונלי (לניתוח ציטומטריית זרימה): הוסף 10 μL של נוגדן מכתים CD14-FITC (fluorescein isothiocyanate) עם דגירה עוקבת למשך 15 דקות ב 4-8 ° C. עיין בניתוח ציטומטריית זרימה בשלב 5 לקבלת פרטים.
   7. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS, וצנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
   8. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ FACS לכל 1 × 10⁸ תאים.
   9. הכנס את עמודת הפרדת התאים האימונומגנטית למפריד (מחזיק הטור המגנטי), ומקם צינור איסוף של 15 מ"ל מתחת לשקע העמוד לאיסוף הזרימה.
   10. שטפו את העמוד עם 1 מ"ל של מאגר FACS נטול גזים. לאחר שטיפה, להחליף את צינור 15 מ"ל משומש עם אחד חדש.
   11. אפשר לתרחיף התא (משלב 1.2.8) לעבור דרך העמודה על-ידי צנרת 1 × 10⁸ תאים במאגר של 500 מיקרוליטר בכל פעם.
       הערה: שימו לב לא ליצור בועות אוויר בעת ערבוב התאים לפני שאתם מאפשרים להם לעבור את העמודה.
   12. שטפו את העמוד 3x עם 3 מ"ל של מאגר FACS נטול גז בכל פעם.
   13. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל הראשון הזה כשבר תא CD14 (PBMCs פחות מונוציטים CD14⁺); זה נקרא גם מקטע הלימפוציטים הנאיביים.
       הערה: תאי CD14⁻ נשמרים בתווך תרבית שלם עד לייצור MoDCs פועמים באנטיגן.
   14. הסר את העמודה מהמפריד.
   15. מניחים צינור סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל מתחת לעמוד לאיסוף הקולחים.
   16. פיפטה 5 מ"ל של חיץ FACS לתוך העמודה, ומיד לדחוף אותו באמצעות בוכנה.
   17. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל השני הזה כשבר התא CD14⁺; זה נקרא גם מקטע מונוציטים נאיבי.
   18. הוסף מדיום תרבית שלם למונוציטים CD14⁺ שנקטפו כדי להשיג 1 × 10⁶ תאים/מ"ל
       הערה: ספור את התאים החיים בחלק התא CD14⁺ המדולל כדי להעריך את נפח מדיום התרבית המלא הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
   19. קח צלחת סטרילית של 24 בארות, והוסף 1 מ"ל של תרחיף התא (1 × 10⁶ תאים / מ"ל) לכל באר.
3. בידול של מונוציטים נאיביים CD14⁺ ל-MoDCs נאיביים על ידי תוספת של קוקטייל ציטוקינים 3% w/v (GM-CSF + IL-4) עם סך של 5 ימי דגירה
   1. יש להוסיף לכל באר המכילה מונוציטים מסוג CD14⁺ 40 μL (3% w/v) של קוקטייל הציטוקינים המסופק בערכה.
   2. לדגור את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO₂ וב 37 ° C במשך 48 שעות.
   3. ביום השני, העבירו מחצית מתכולת כל באר (500 מיקרוליטר) באמצעות פיפטה לצינורות בודדים של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם ב-4°C למשך 7 דקות.
   4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם טרי.
   5. העבר 500 μL של תרחיף תא זה משלב 1.3.4 בחזרה לכל באר ייעודית, כך שהנפח הסופי הוא 1 מ"ל.
   6. העשירו כל באר ב-20 מיקרוליטר קוקטייל ציטוקינים.
   7. לדגור על התרבית במשך 72 שעות באינקובטור לח עם 5% CO₂ וב 37 ° C.
   8. לאחר הדגירה ביום 5, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור.
      הערה: כל באר תכיל 1 מ"ל של תרחיף תאים של MoDCs נאיביים. מספר MoDCs יהיה אחוז (~ 20%) מהמונוציטים המקוריים המצופים (1 × 10⁶/mL).

2. יצירת MoDCs בפולסי אנטיגן

הערה: חיסון זמין מסחרית ומאושר קלינית נגד נגיף הכלבת (RV) יכול לגרום להבחנה של MoDCs נאיביים ל-MoDCs בוגרים מציגי אנטיגן. השתמש ב-0.1% (~1 μL) של מנת חיסון אחת נגד קרוואנים כדי לייצר MoDCs עם פעימות אנטיגן. יתר על כן, עדיף לייצר MoDCs פועמים של קרוואנים באותה צלחת תרבית המשמשת ליצירת MoDCs נאיביים, מכיוון שהעברת MoDCs נאיביים לצלחת חדשה בת 24 בארות תשפיע עליהם לרעה.

1. הוסף 1 μL / מ"ל של מתלה RV ל 1 מ"ל של תרבית MoDC נאיבית בצלחת 24 בארות, ודגור במשך 48 שעות ב 5% CO₂ ו 37 ° C.
   הערה: MoDCs נאיביים שגודלו בתרבית ללא גירוי RV משמשים כבקרת רקע (וכגירוי לא ספציפי לתרבית משותפת עם לימפוציטים בשלבים הבאים).
2. לאחר הדגירה, ביום השביעי, יש לשמור את הצלחת בת 24 הקידוחים המכילה את פעימות האנטיגן MoDCs על קרח למשך 10 דקות.
3. הוסף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל באר. מערבבים היטב כל באר על ידי פיפטינג, ומעבירים את המתלה לצינור 15 מ"ל.
4. שטפו את הבארות עם 2 מ"ל של PBS קר כקרח כדי לאסוף את התאים השיוריים שנותרו בתוך כל באר.
5. העבירו את התכולה לצינורות המתאימים שלהם, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 7 דקות.
6. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את כדורית התא (MoDCs בפולסי אנטיגן) בתווך תרבית שלם, ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז התא הסופי של 1 × 10⁵ תאים/mL.
   הערה: ספור את התאים החיים כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה. השתמש ב- MoDCs פועמים של קרוואנים מהיום השביעי עבור מערכת התרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC.

3. תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC

הערה: מערכת התרבית המשותפת של לימפוציטים במבחנה MoDC-לימפוציטים קובעת את היכולת של MoDCs לראשוני לימפוציטים ספציפיים לאנטיגן. קבוצות הטיפול השונות של תאים לאחר 16 ימים של תרבית משותפת כוללות ספציפיות, לא ספציפיות וביקורת. הקבוצה הספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs פועמים RV; הקבוצה הלא ספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs שאינם פועמים באנטיגן; וקבוצת הביקורת מוגדרת כלימפוציטים בתרבית ללא MoDCs.

1. הוסף מדיום תרבית שלם למקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל (תאי CD14^-) כדי להשיג ריכוז תאים של 2 × 10⁶ תאים/מ"ל
   הערה: ספור את התאים החיים בתרבית התאים CD14 ^שנשמרו בתווך תרבית שלם בצלחת של 24 בארות מאז איסופם כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
2. ביום השביעי, קחו צלחת סטרילית בת 24 בארות, וזרעו את הבארות עם 1 מ"ל של תרחיף תאי לימפוציטים נאיבי (2 × 10⁶ תאים/מ"ל) בתוספת 1 מ"ל של תרחיף MoDC בפולס אנטיגן או ללא פעימות אנטיגן (1 × 10⁵ תאים/מ"ל).
   הערה: הנפח הכולל בכל באר יהיה 2 מ"ל עם יחס של 1:20 MoDCs ללימפוציטים לכל באר.
3. לדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
4. העשרה ורסטימולציה בתרבית עם MoDCs בפולסי אנטיגן
   1. לאחר הדגירה של תרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמת אנטיגן, ביום 9, להשלים כל באר עם 20 ng/mL רקומביננטי IL-2, ולהמשיך לדגור עוד 120 שעות (5 ימים דגירה).
   2. ביום ה-14, העבירו 1 מ"ל של התרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 7 דקות.
   3. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את כדורית התא עם 1 מ"ל של MoDCs דופקי אנטיגן או לא פועמים (1 × 10⁵ תאים/מ"ל). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג, ומעבירים את מתלי התאים בחזרה לבארות המיועדות להם.
      הערה: בשלב זה, הנפח הכולל בכל באר הוא 2 מ"ל.
   4. המשך עם הדגירה ב 5% CO₂ ו 37 ° C במשך 48 שעות. לאחר הדגירה ביום ה -16, התרבות המשותפת מוכנה לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה, qPCR ו- ELISA.
      הערה: עבור כל 2 מ"ל בכל באר של תרבית לימפוציטים MoDC, 1 מ"ל של תאים מרחפים מוכתמים עבור ציטומטריית זרימה, 1 מ"ל משמש למיצוי RNA, והסופרנאטנטים משניהם משמשים עבור ELISA.

4. אנליזה ציטומטרית של זרימה

הערה: צבעו את התאים בסמנים מתאימים/mAb לפני הפעלת הדגימות על ציטומטר זרימה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים (צביעת mAb ופקדי איזוטיפ), ערכה, מכשיר ותוכנה המשמשים לניתוח ציטומטריית זרימה.

1. פרוטוקול צביעת ציטומטר זרימה
   הערה: בצע צביעת פני התא עבור PBMCs ולימפוציטים נאיביים ומונוציטים באמצעות anti-CD14 mAb (שלב 1.2.6). לצביעת פני התא של MoDCs נאיביים, השתמש ב- mAb ספציפי ל- CD86, ספציפי ל- CD40 וספציפי ל- MRC II. עבור צביעת פני התא של תאים מהיום 16 תרביות משותפות, השתמש אנטי CD4, אנטי CD8, ו anti-CD25 mAbs; עבור צביעה תוך תאית, להשתמש אנטי Ki-67 mAb. יתר על כן, להכתים את התאים עם בקרת איזוטיפ שלילי mAb או ללא mAb (FMO: פלורסנט מינוס אחד). ההבדל העיקרי בעת צביעה עבור פני השטח וסמנים תוך תאיים הוא כי עבור סמנים פני התא, התאים חייבים להיות מוכתמים עם mAb משטח ספציפי לפני צביעה חיה / מת (L / D) או כל תהליך אחר. עם זאת, צביעה תוך תאית מבוצעת לאחר צביעת L/D ודורשת קיבוע בתוספת שלב חדירה כדי לאפשר חדירה תוך תאית.
   1. העברת 1 מ"ל של תרחיף תאים לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × g.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, בעת עיבוד התאים מתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC, שמור את הסופרנאטנט לניתוח ELISA.
   2. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. לאסוף את התאים שיורית באמצעות 1 מ"ל של PBS, ולשלב את זה עם גלולה resuspended.
   3. הוסף 10 מ"ל PBS לצינור 15 מ"ל המכיל את התאים, ערבב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה במשך 7 דקות ב 850 x גרם.
   4. השליכו את הסופר-נאטנט וחזרו על שלב 4.1.3.
   5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו בזהירות את כדורית התא עם המתלה השיורי (כ-180 מיקרוליטר) שנותר לאחר פירוק הסופרנטנט.
   6. העבירו את מתלה התא לצלחת V בעלת 96 בארות, ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.
   7. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הצלחת מעל מיכל פסולת כדי לרוקן את בארות הנוזלים, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להבטיח סילוק נוזלים עודפים.
   8. יש להוסיף 25 μL של תערובת מאסטר לצביעת פני השטח לכל באר, ולערבב בעדינות באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות
      הערה: כדי להכין את תערובת האב לצביעת פני השטח עבור באר אחת, הוסף 2.5 μL של mAb פני השטח ל- 20 μL של מאגר FACS.
   9. הוסף 200 μL של חיץ FACS לכל באר, וצנטריפוגה ב 1,400 × גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, רוקנו את הבארות מנוזלים על ידי ניקוז, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להסיר נוזלים עודפים.
   10. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה L/D לכל באר. יש לערבב היטב באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות בחושך.
       הערה: עבור באר בודדת, יש להמיס 0.25 μL של צבע L/D ב-100 μL של חיץ FACS. צבע L/D מסייע להבחין בין תאים חיים ומתים.
   11. הוסף 100 μL של מאגר FACS. מכסים את הבארות במכסה, וצנטריפוגות את הצלחת למשך 1,400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
   12. חזור על שלב 4.1.11.
   13. מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר (מסופקת עם הערכה), ומערבבים עם פיפטה לפני הדגירה על הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות.
   14. הוסף 150 μL של 1x permeabilization-wash buffer (PW) שסופק עם הערכה, ולכסות את הבארות עם המכסה.
       הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 1x PW חיץ לדלל 1 מ"ל של 10x חיץ perm ב 10 מ"ל של dH₂O.
   15. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant על ידי decanting, והקשה על הצלחת על נייר סופג.
   16. הוסף 200 μL של 1x PW, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant על ידי decanting, והקש על הצלחת על נייר סופג.
   17. עבור צביעה תוך תאית, להוסיף 25 μL של צביעה תאית תערובת אב צביעה (Ki-67 mAb אנטי אנושי) לכל באר. מערבבים היטב, ודגרים על הצלחת במשך 30 דקות ב 4 ° C או על קרח בחושך.
       הערה: כדי להכין את תערובת האב צביעה תאית עבור באר אחת, להוסיף 1 μL של Ki-67 mAb ל 24 μL של 1x PW. סמן הצביעה התוך-תאי משמש רק בעת עיבוד תאים מהיום ה-16 לתרבית משותפת. צביעה תוך תאית אינה נעשית בעת עיבוד PBMCs, לימפוציטים נאיביים, מונוציטים ו- MoDCs נאיביים.
   18. לאחר הדגירה, יש להוסיף 200 μL של 1x PW לכל באר. מערבבים עם פיפטה וצנטריפוגה במשך 1,400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
   19. הוסף 200 μL של חיץ FACS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
   20. השהה מחדש את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של מאגר FACS, והעבר את התוכן של כל באר לצינורות ציטומטר זרימה סטריליים נפרדים. השתמש 300 μL של חיץ FACS לכל באר כדי לאסוף את התאים שיורית. התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה.
2. הרצת הדגימה על ציטומטר זרימה
   הערה: הדגימות הופעלו על ציטומטר זרימה (באמצעות לייזרים של 488 ננומטר, 638 ננומטר ו-405 ננומטר) על פי מדריך היצרן. עיין במדריך לקבלת פרטים, פתרון בעיות והתאמה אישית של הפרוטוקול.
   1. בצע הליכי ניקוי שגרתיים לפני ואחרי קריאת הדגימות.
      הערה: אין לדלג על תנוחה בעת טעינת הצינורות במכשיר.
      1. עבור מחזור הניקוי, השתמש בסך הכל בארבעה צינורות, כאשר הצינור הראשון מכיל מגיב ניקוי זרימה ושלושת הצינורות הנותרים מכילים dH₂O; כל צינור יהיה 3 מ"ל. במהלך ריצת הניקוי, קבל נתונים עם קצב זרימה בינוני למשך כדקה אחת על-ידי לכידת 100,000 אירועים לכל צינור מתחת ל- 330 V עבור פיזור קדימה (FSC) לעומת 265 V עבור פיזור צדדי (SSC).
         הערה: אין לדווח על לכלוך או אירועים סלולריים במהלך הניקוי; במקרה כזה, בצעו שוב את שלב הניקוי. להפעלת הדגימות, ודא שכל הדגימות נמצאות בהשעיה הומוגנית לפני קבלת הנתונים מכיוון שהדבר מבטיח קריאה מדויקת.
   2. כדי לחבר ולהפעיל את הציטומטר, לחץ על כפתור היישום הממוקם בפינה השמאלית של פס הכותרת. מהתפריט הנפתח של היישום, בחר באפשרות Cytometry ולחץ על האפשרות Power On.
      הערה: מהתפריט הנפתח של היישום, האפשרות פתח מאפשרת למשתמשים לעיין בבדיקות המתוכנתות מראש, בעוד שהאפשרות פרוטוקול חדש מאפשרת למשתמשים ליצור פרוטוקולים חדשים.
   3. בתחילה לטעון את דגימת הבקרה השלילית במחזיק multi-tube. בחר פרוטוקול חדש והתבונן ברשימת העבודה בצד שמאל של סביבת העבודה/המסך.
   4. ברשימת העבודה, הגדר את מיקום הדגימה במחזיק מרובה הצינורות, ותן שם לדגימה ולפרוטוקול לזיהוי.
   5. מלוח החומרה הממוקם בצד שמאל של סביבת העבודה, התאם ובחר פרמטרים מרובים כגון הגלאים (FSC, SSC ו- 10 טווחי פלואורסצנטיות), המתחים (V) והרווחים של מכפילי האור, והשטח-גובה-רוחב (AHW) של האות.
      הערה: ההגדרות הבאות עבור הגלאים נבחרו על סמך הניסוי והמכשיר בו נעשה שימוש: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. מלוח הבקרה של רכישת מכשירים הממוקם מתחת לפס הכותרת, התאם את האפשרויות עבור קצב זרימה (בינוני), זמן (5 דקות) ואירועים (ראה שלב 5.2.8) הרצויים לזיהוי. לחץ על האפשרות רכוש יחיד כדי לאפשר למכשיר לצייר / להריץ את הדגימה ולהציג את התצוגה המקדימה בזמן אמת של האירועים שזוהו.
   7. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הפלואורסצנטיות (מתח ורווח) ואת גודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת פסולת תאית.
      הערה: FSC מסייע להבחין בין תאים על בסיס גודל, ובכך מאפשר למשתמשים להבדיל בין תאים של המערכת החיסונית, כגון מונוציטים ולימפוציטים; מונוציטים גדולים יותר ומראים עוצמת FSC גבוהה יותר בהשוואה ללימפוציטים.
   8. לרכוש בסך הכל כ-5,000 MoDCs חיים, 50,000 לימפוציטים חיים ו-50,000 אירועי מונוציטים חיים.
   9. לאחר שכל הפרמטרים מותאמים בהתייחסות למדגם הבקרה השלילית, לחץ על עצור ושמור את הפרוטוקול.
   10. כעת טען את כל הדגימות על המעמיס מרובה הצינורות. הגדר כל דגימה ברשימת העבודה, והחל את הפרמטרים המותאמים ביחס לבקרה השלילית על כל הדגימות בניסוי. לחץ על האפשרות רכוש כדי לאפשר את כל הדגימות בניסוי לרוץ ברציפות.
   11. לאחר רכישת הנתונים מכל הדגימות, שמור והפוך לנתונים קריאים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה המאפשרת יצירת היסטוגרמות דו-פרמטריות ומונו-פרמטריות רציפות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ACK Lysing Buffer	גיבקו, תרמו פישר	A1049201	חיץ אמוניום-כלוריד-אשלגן עבור ליזה של RBCs שיורית במקטע PBMC שנקצר
ערכת גידול תאים דנדריטיים של בקר	Bio-Rad, בריטניה	PBP015KZZ	קוקטייל ציטוקינים המורכב מפרות רקומביננטי IL-4 ו-GMCSF
ערכת ELISA IFN-γ בקר	ביו-ראד	MCA5638KZZ	שימוש בערכה למדידת ביטוי IFN-γ בסופרנאטנט תרבות
כלבת נוביבאק	MSD Animal Health, בריטניה		1 μL/mL של חיסון מומת בתרבית תאים המכיל> 2 זן וירוס כלבת I.U./mL
אטמים אופטיים	בי0-ראד	TCS0803	0.2 מ"ל צינור PCR שטוח 8 רצועות כובע, אופטי, אולטרה-ברור, תואם למכונת qPCR
מלח חיץ פוספט (PBS)	גיבקו, תרמו פישר	10010023	pH 7.4, ריכוז 1x
צינור FlowTubes/ FACS (Fluorescenceactivated single-cell sorting)	פלקון קורנינג	352235	5 מ"ל, סטריאלי, מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן עם מכסה הצמדה למסננת תאים, לשימוש בניתוח ציטומטריית זרימה
מיקרו-חרוזים CD14 אנושיים	Miltenyi Bioteck, גרמניה	130-050-201	2 מיקרו-כדוריות מ"ל מצומדות לאיזוטיפ נוגדן CD14 אנטי-אנושי חד-שבטי IgG2a, המשמש לבחירת מונוציטים של בקר מ-PBMCs
נוגדן Ki-67 אנטי-אנושי מטוהר	Biolegend, ארצות הברית	350501	נוגדן חד שבטי, צולב תגובתי עם פרה, שיבוט ki-67
סל"ד 1640 בינוני	סיגמא אולדריץ'	₪220	מדיה לתרבית תאים עם L-גלוטמין וסודיום ביקרבונט
צלחת בדיקה לתרבית רקמות 24	TPP, שוויץ	92024	צלחת באר 24, מעוקרת על ידי קרינה, צמיחה משופרת מטופלת, נפח 3.18 מ"ל