בדיקת הפרעה המוציטית להערכת היצמדות חוזרת של המוציטים לכיסים המטופויטיים

תקציר

מקור: Petraki, S. et al., Assay אוכלוסיות תאי דם של זחל Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

סרטון זה מדגים את בדיקת הפרעות ההמוציטים, ומעריך הידבקות חוזרת של המוציטים בכיסים ההמטופויטיים של זחלי דרוזופילה. הפרעה מכנית משחררת המוציטים תושבים, ומעלה את ספירת ההמוציטים במחזור. לאחר ההחלמה, דבקות מחדש של המוציטים תושב הוא אישר, הממחיש הפיכות.

פרוטוקול

1. בדיקת דימום/גירוד המוציטים

1. הכנת שקופיות:
   1. אפשרות 1 עבור מיקרוסקופים ללא פונקציית סריקת אריחים: עבור כל זחל שיש לנתח, הכינו שקופית זכוכית אחת עם כ-5 בארות עט פאפ של ריבועים בגודל 2 מ"מ כל אחת, בהתאם לאזור הצפייה בשדה של המיקרוסקופ; הוסיפו בערך 5-10 מיקרוליטר של מדיה S2 לכל אחת מהן (איור 1A). יש לשמור את המגלשות בתא לח כדי למנוע התייבשות בארות.
   2. אפשרות 2 עבור מיקרוסקופים עם פונקציית סריקת אריחים: עבור כל זחל שיש לנתח, הכינו שקופית זכוכית אחת עם 3 עד 4 בארות עט פאפ של ~3 - 4 ריבועים כל אחת; הוסיפו בערך 15 - 20 מיקרוליטר של מדיה S2 לכל באר (איור 1B). שמור שקופיות בתא לח כדי למנוע בארות להתייבש.
      הערה: מספר הבארות המומלץ לעיל מספיק לסך של עד 3,000 המוציטים לזחל (זחלי כוכב^{שני מאוחרים}, ~ 2.5 - 3 מ"מ אורך, טרנסגן המסמן את רוב תאי הדם של הזחל). בעת הערכת מספר תאי דם גדול יותר, ייתכן שיהיה צורך בבארות נוספות כדי למנוע צפיפות.
2. אוסף הזחלים:
   1. התיזו מים לתוך בקבוקון זבובים המכיל זחלים ושטפו זחלים לתוך צלחת פטרי, או גרפו מזון המכיל זחלים לתוך צלחת פטרי ודללו במים באמצעות בקבוק להשפריץ.
   2. קוטפים בעדינות זחלים מתוך צלחת הפטרי בעזרת מברשת צבע ומניחים אותם במים בכלי חלל או על מגלשה על גוש קר.
      הערה: הזחלים יכולים להישמר לזמן מוגבל במים או על בלוק קר; השתמש בדגימות תוך 45 דקות או פחות כדי למנוע מוות של זחלים או השפעות לא רצויות על המוציטים.
3. נתיחה:
   1. בחר זחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על גוש מתכת קר. מדדו גדלים וזחלי תמונה אם תרצו.
   2. בידוד של המוציטים במחזור ("דימום"):
      1. לאחר בחירת הזחלים, הניחו זחל אחד בבאר הפאפ הראשונה (איור 1C, 2A).
      2. השתמש 2 מחטים נקיות או מספריים לנתח ומלקחיים כדי לבצע חתך בשני הקצוות האחוריים והקדמיים של הזחל. כדי למנוע הפרעה המוציטים תושב, עדיף לעשות חתכים אלה בצד הגחון של הזחל. לקבלת תוצאות עקביות, בצע את החתכים באותם מיקומים עבור כל זחל. עבור 1^זחלי instar רחוב, חתך אחד (בחלק הקדמי הגחוני) מספיק.
      3. אפשרו לזחל לדמם במשך כמה שניות ללא כל לחץ או תסיסה פיזית (איור 2A).
         הערה: אם עובדים על מספר זחלים, עדיף לבצע חתכים אלה עבור כל אחד מהם לפני שממשיכים לשלב הבא, כדי להימנע מהשארת הזחלים על קרח זמן רב מדי, מה שעלול להשפיע על שלמות הדגימות.
      4. הרימו בעדינות את הזחל עם המחטים או המלקחיים וטבלו אותו בבאר השנייה כדי לשטוף את כל ההמוציטים שנותרו במחזור. לאחר מכן, בצע עם שחרורו של hemocytes תושב.
   3. בידוד של המוציטים תושבים ("גירוד"):
      1. העבירו בעדינות את הזחל לבאר הבאה (איור 2C).
      2. זהה את בלוטת הלימפה של הזחל, אשר בדרך כלל ממוקמת כ 1/3 מן הקצה הקדמי של הזחל, אשר עשוי פלואורס גבי דרך דופן גוף הזחל. הימנעו משימוש בבלוטת הלימפה בזמן שאתם משחררים המוציטים מקומיים על-ידי הצמדת הזחל עם מחט קרוב ככל האפשר לבלוטת הלימפה כדי למנוע ניקוב (איור 2C).
         הערה: במהלך התפתחות נורמלית, ההתבגרות של המוציטים בלוטת הלימפה מתעכבת בהשוואה להמוציטים של הזחלים, ומדווחים פלואורסצנטיים של המוציטים מובחנים עשויים שלא להראות אות בבלוטות הלימפה של זחלים צעירים. במקרים אלה, יש להקדיש פחות תשומת לב לבלוטת הלימפה מכיוון שלא צפוי זיהום של המוציטים זחלים בעלי תווית פלואורסצנטית מובחנת על ידי המוציטים של בלוטת הלימפה.
      3. שחרור תאי דם מקומיים בתהליך דיסקציה של גירוד ו / או נגיחה. השתמש במחט אחת כדי להצמיד ביעילות את הזחל ליד בלוטת הלימפה (ראה לעיל) או אזורי גוף אחרים לפי הצורך. השתמשו במחט נוספת כדי לנגוח באשכולות של המוציטים שנראים דרך דופן גוף הזחל (איור 2C, E), במטרה להפריד בין ההמוציטים. המוציטים יכולים להשתחרר גם בתנועת גירוד. עם זאת, קריעת האפידרמיס מוקדם עשויה לשחרר אשכולות גדולים של תאי דם, מה שעלול להפוך את הספירה האוטומטית למאתגרת יותר.
         הערה: בהתאם לגיל ולגנוטיפ של הזחל, מספר ההמוציטים הכולל ישתנה. פזרו את תהליך השחרור המתואר לעיל על פני מספר בארות כדי למנוע צפיפות יתר של כמה בארות עם תאי דם, מה שעלול להקשות על ניתוח תמונה של תא בודד.
      4. אם נותרו מעט המוציטים בפגר הסופי, ספרו את ההמוציטים האלה באמצעות תצפית דרך המיקרוסקופ ושימוש במונה ידני (איור 2E). כדי להקל על הספירה, הניחו את הפגר על אזור נקי באותה מגלשה ופרשו אותו דק ככל האפשר כדי להפחית את מספר המישורים האופטיים.
      5. לאחר השלמת הדיסקציה, המתן בין 5 - 10 דקות עד שהתאים ישקעו (אך לא בהכרח ידבקו) לפני הדמיה של הבארות. יש לדגור על המגלשה בתא לח כדי למנוע התייבשות, ולהימנע מטיפול גס במגלשות, שעלול להפריע להמוציטים המשוקעים.
         הערה: בעת קביעת ספירת המוציטים, התאים המשתחררים אינם קבועים ויש לצלם את התאים זמן קצר לאחר הדיסקציה, רצוי תוך 30 דקות לאחר שחרורם מהזחל. בהתאם לנפח של תכונות התווך והתאי, הרוב המכריע של התאים יתיישבו בתוך 5 - 10 דקות, אשר צריך להיות מאושר על ידי התמקדות דרך המישורים האופטיים של התווך בבאר. עם זאת, רק חלק קטן מתאי הדם נדבקו למשטח השקופיות בשלב זה, עובדה שיש לקחת בחשבון אם משנים פרוטוקול זה לגישות מבוססות קיבוע תאים.
4. כימות:
   1. צלמו תמונות של ההמוציטים המיושבים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2B, D, F). לאחר מכן בצע כימות של המוציטים באמצעות תוכנת ImageJ.
   2. הכן את התמונה לאלגוריתם ספירת התאים של ImageJ:
      1. פתח את תמונת הבאר באמצעות ImageJ: File → Open → (אתר קובץ ובחר).
      2. ודא שהתמונות הן של 8 סיביות או 16 סיביות. התאם את הסף עבור התמונה על-ידי בחירה באפשרות תמונה ולאחר מכן לחץ על התאם ובחר סף. התבוננו ב"חלון הסף" (איור 3A).
      3. סמן את האפשרות "רקע כהה". בחר "אדום" והגדל את רמת הסף התחתונה (ראה חץ שחור) עד שכל תא בתמונה יסומן בנקודה אדומה (תאים שאינם מכוסים ייראו בגווני אפור; איור 3B). ככל שהסף התחתון גדל, חלק מהתאים יהפכו ללא מסומנים. זה יכול להיות אינדיקטור של כמה רחוק להגדיר את הסף התחתון.
         הערה: לעיתים לא ניתן לפתור צבירי תאים והם ייספרו כאחד על ידי מונה החלקיקים. במקרים כאלה, ניתן להעריך את מספר התאים באשכול על ידי בחינת התמונה (התקרבות במידת הצורך) וספירה ידנית באמצעות מונה ספירה. לחלופין, ניתן להגדיל את הסף התחתון כדי לפתור צבירי תאים; לאחר מכן ניתן לספור תאים לא מסומנים הנובעים ממניפולציה זו באמצעות מונה ספירה.
   3. ניתוח מספר תא באמצעות ImageJ:
      1. הפעילו את מנתח החלקיקים כדי לספור את התאים (איור 3C). בחר נתח ולחץ על נתח חלקיקים. לחלופין, בחר "קווי מתאר של שכבת-על" כדי לראות את החלקיקים שהאלגוריתם סופר (איור 3D). לחלופין, הגדר מגבלה לגודל או לאזור הפיקסלים של יחידה (למשל, תא, גוש תאים וכו') כדי שהאלגוריתם ייחשב.
      2. לחץ על אישור. התבוננו בחלון סיכום עם הספירה (איור 3E).

2. בדיקת הפרעות המוציטים

1. כדי להפריע המוציטים, בחר זחלים ומניחים אותם בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל עם כ 0.5 גרם של חרוזי זכוכית (212 - 600 מיקרומטר) ולהוסיף 0.5 מ"ל מים.
2. מערבלים את הצינור, ביד, במהירות 10 למשך דקה.
3. שלפו את הזחלים מחרוזי הזכוכית על ידי שפיכת תכולת צינור המיקרוצנטריפוגה לתוך צלחת פטרי ובחירת הזחלים בעזרת מכחול.
4. לשלב ההתאוששות, הניחו את הזחלים בצלחות פטרי שהוכנו בעבר עם כמויות קטנות של מזון לזבובים. אפשר לזחלים להקים מחדש את דפוס ההמוציטים שלהם לתקופה של 45 דקות או לפי הצורך.
   הערה: השליכו את כל הזחלים שהפסיקו לנוע, מכיוון שהם מתו בתהליך. עם זאת, בדרך כלל אנו רואים נזק קטן לאחר דקה אחת של מערבולת.
5. לאחר תקופת ההחלמה, המשך עם בדיקת הדימום/גירוד כמתואר לעיל בסעיף 1.

תוצאות

איור 1. Hemocyte Bleed/Scrape and Disturbance Assay הגדרה וסכמטית. (א)הגדרת שקופית תמונה יחידה: חמישה ריבועים בקוטר 2 מ"מ להדמיה עם מטרה של 5X. (B) סריקת אריחים הגדרת שקופית: ארבעה ריבועים בקוטר 3 מ"מ להדמיית דימום/שריטות של זחלי ≤2.5 מ"מ עם מיקרוסקופ סריקת אריחים. המטרות המומלצות להדמיה הן 5X או 10X. (C) סכמת Bleed/Scrape Assay וכימות כתוצאה מכך באמצעות ImageJ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי 6 ס"מ / 9 ס"מ			אחד לכל גנוטיפ שיש להעריך
בקבוק התזת מים
כף מתכת/מרית
מברשת צבע דקה			למשל "אניה"
צלחת חלל זכוכית
עט פאפ: Super PAP PEN IM3580	בקמן קולטר
שקופיות זכוכית			על כל שקופית מצוירים 5 ריבועי PAP PEN או יותר. גודל הריבועים תלוי במטרת ההדמיה ובהגדלה של מצלמת המיקרוסקופ; למשל ריבועים בקוטר 2 מ"מ.
תא לח			זה ישמש למניעת התייבשות של מגלשות ובארות: מיכל אטום עם מגבות נייר רטובות המרפדות את הצדדים/תחתית
מדיה של תרבית תאי דרוזופילה של שניידר	Invitrogen
בלוק קר			זהו גוש מתכת (המכונה בלוק חימום) מקורר בדלי המכיל קרח; רצוי בצבע שחור או בצבע כהה אחר שאינו מחזיר אור
שני מזרקים 1 מ"ל עם מחטים (27 גרם 1/2)	בקטון דיקינסון		לנתיחות.
אופציונלי: מספריים קפיציים כירורגיים (קצה חיתוך 2 מ"מ)	כלים מדעיים משובחים
חרוזי זכוכית, 212-600 מיקרון	סיגמא
2 מ"ל צינורות אפנדורף	אפנדורף		אחד לכל הערכת גנוטיפ
מערבול מיקסר	פישר סיינטיפיק
זחלי דרוזופילה טרנסגניים עם המוציטים מסומנים פלואורסצנטית. טרנסגנים מתאימים כוללים: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP ו- -GFP (Gajewski et al., 2007), או HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), או eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) בשילוב עם UAS-GFP או טרנסגנים חלבוניים פלואורסצנטיים אחרים.
מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי	לייקה		כאן: Leica M205, אופציונלי עם מצלמה, תוכנת הדמיה ומודול מדידה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם חיבור מצלמה	לייקה או קיינס		עם או בלי פונקציית סריקת אריחים (למשל. סדרת Leica DMI, סדרת Keyence BIOREVO BZ-9000)