בדיקת הפרעה המוציטית להערכת היצמדות חוזרת של המוציטים לכיסים המטופויטיים

תקציר

מקור: Petraki, S. et al., Assay אוכלוסיות תאי דם של זחל Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

סרטון זה מדגים את בדיקת הפרעות ההמוציטים, ומעריך הידבקות חוזרת של המוציטים בכיסים ההמטופויטיים של זחלי דרוזופילה. הפרעה מכנית משחררת המוציטים תושבים, ומעלה את ספירת ההמוציטים במחזור. לאחר ההחלמה, דבקות מחדש של המוציטים תושב הוא אישר, הממחיש הפיכות.

פרוטוקול

1. בדיקת דימום/גירוד המוציטים

1. הכנת שקופיות:
   1. אפשרות 1 עבור מיקרוסקופים ללא פונקציית סריקת אריחים: עבור כל זחל שיש לנתח, הכינו שקופית זכוכית אחת עם כ-5 בארות עט פאפ של ריבועים בגודל 2 מ"מ כל אחת, בהתאם לאזור הצפייה בשדה של המיקרוסקופ; הוסיפו בערך 5-10 מיקרוליטר של מדיה S2 לכל אחת מהן (איור 1A). יש לשמור את המגלשות בתא לח כדי למנוע התייבשות בארות.
   2. אפשרות 2 עבור מיקרוסקופים עם פונקציית סריקת אריחים: עבור כל זחל שיש לנתח, הכינו שקופית זכוכית אחת עם 3 עד 4 בארות עט פאפ של ~3 - 4 ריבועים כל אחת; הוסיפו בערך 15 - 20 מיקרוליטר של מדיה S2 לכל באר (איור 1B). שמור שקופיות בתא לח כדי למנוע בארות ....

תוצאות

איור 1. Hemocyte Bleed/Scrape and Disturbance Assay הגדרה וסכמטית. (א)הגדרת שקופית תמונה יחידה: חמישה ריבועים בקוטר 2 מ"מ להדמיה עם מטרה של 5X. (B) סריקת אריחים הגדרת שקופית: ארבעה ריבועים בקוטר 3 מ"מ להדמיית דימום/שריטות של זחלי ≤2.5 מ"מ עם מיקרוסקופ סריקת אריחים. המטרות המומלצות להדמיה הן 5X או 10X. (C) סכמת Bleed/Scrape Assay וכימות כתוצאה מכך באמצעות ImageJ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי 6 ס"מ / 9 ס"מ			אחד לכל גנוטיפ שיש להעריך
בקבוק התזת מים
כף מתכת/מרית
מברשת צבע דקה			למשל "אניה"
צלחת חלל זכוכית
עט פאפ: Super PAP PEN IM3580	בקמן קולטר
שקופיות זכוכית			על כל שקופית מצוירים 5 ריבועי PAP PEN או יותר. גודל הריבועים תלוי במטרת ההדמיה ובהגדלה של מצלמת המיקרוסקופ; למשל ריבועים בקוטר 2 מ"מ.
תא לח			זה ישמש למניעת התייבשות של מגלשות ובארות: מיכל אטום עם מגבות נייר רטובות המרפדות את הצדדים/תחתית
מדיה של תרבית תאי דרוזופילה של שניידר	Invitrogen
בלוק קר			זהו גוש מתכת (המכונה בלוק חימום) מקורר בדלי המכיל קרח; רצוי בצבע שחור או בצבע כהה אחר שאינו מחזיר אור
שני מזרקים 1 מ"ל עם מחטים (27 גרם 1/2)	בקטון דיקינסון		לנתיחות.
אופציונלי: מספריים קפיציים כירורגיים (קצה חיתוך 2 מ"מ)	כלים מדעיים משובחים
חרוזי זכוכית, 212-600 מיקרון	סיגמא
2 מ"ל צינורות אפנדורף	אפנדורף		אחד לכל הערכת גנוטיפ
מערבול מיקסר	פישר סיינטיפיק
זחלי דרוזופילה טרנסגניים עם המוציטים מסומנים פלואורסצנטית. טרנסגנים מתאימים כוללים: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP ו- -GFP (Gajewski et al., 2007), או HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), או eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) בשילוב עם UAS-GFP או טרנסגנים חלבוניים פלואורסצנטיים אחרים.
מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי	לייקה		כאן: Leica M205, אופציונלי עם מצלמה, תוכנת הדמיה ומודול מדידה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם חיבור מצלמה	לייקה או קיינס		עם או בלי פונקציית סריקת אריחים (למשל. סדרת Leica DMI, סדרת Keyence BIOREVO BZ-9000)