טכניקת צביעת טטרמר פפטיד-MHC-I לניתוח תאי זיכרון מסוג CD8+ ספציפיים ל-SIV

תקציר

מקור: Gonzalez-Nieto, L., et al. ניתוח של Simian Immunodeficiency Immunodeficiency Virus ספציפי CD8⁺ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שיטה לאפיון תאי זיכרון CD8⁺ מסוג T ספציפיים לנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) באמצעות טטרמרים מסוג pMHC-I (pMHC-I). טטרמר pMHC-I הוא קומפלקס של ארבע מולקולות MHC-I הקשורות לפפטידים ספציפיים ל-SIV ומצומדות לפלואורופור. טטרמרים אלה נקשרים באופן סלקטיבי לקולטני תאי T (TCRs) על תאי T CD8⁺ ספציפיים ל- SIV, מה שמקל על אפיון תאים אלה.

פרוטוקול

1. טיפול PKI

הערה: אפשרות זו אופציונלית, אך מומלצת עבור טטרמרים Mamu-B*017:01.

1. השהה PBMC בתווך R10 בריכוז של 1.6 x 10⁷ תאים/מ"ל.
2. הוסף 50 μl של תרחיף תא זה לצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים. הוסף 50 μl של תמיסת 100 ננומטר של PKI לכל צינור.
3. מערבלים כל צינור. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. בסוף שלב זה, כל צינור צריך להיות 100 μl של תרחיף התא המכיל 8.0 x 10⁵ PBMC ו 50 ננומטר של PKI.
4. המשך לשלב צביעת הטטרמר pMHC-I.

2. צביעה בטטרמרים pMHC-I עם תווית פלואורוכרום

1. לפני הכנת תערובת מאסטר טטרמר pMHC-I, צנטריפוגו את צינורות הטטרמר pMHC-I ב 20,000 x גרם במשך 15 דקות לפחות ב 4 ° C. מטרת שלב זה היא לגרוף צברי חלבונים בתמיסת הטטרמר pMHC-I שעלולים להגביר את צביעת הרקע. לאחר סיום שלב הצנטריפוגה, הימנעו מפיפטציה מתחתית הצינור שבו הצטברו צברי החלבון.
2. הכינו מספיק תערובת מאסטר טטרמר pMHC-I כדי להכתים את כל צינורות הניסוי. הכינו עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת האב הזו כדי לקחת בחשבון טעויות צנרת.
3. יש לדלל טטרמרים מסוג pMHC-I במאגר כתמים (לדוגמה, מאגר כתמים מבריק) כך שלכל בדיקה יתווספו 25 μl של תערובת האב של pMHC-I tetramer.
   1. תווית PBMC עם שני טטרמרים pMHC-I בכל בדיקה; אחד מצומד לאלופיקוציאנין (APC) והשני לסגול מבריק (BV) 421.
4. הוסף 8.0 x 10⁵ PBMC לצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים בנפח סופי של 100 μl. אם התאים היו נתונים לטיפול PKI שתואר לעיל, הם כבר צריכים להיות resuspended ב 100 μl בשלב זה.
5. הוסף 25 μl של תערובת מאסטר טטרמר pMHC-I לצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים. בסוף שלב זה, הנפח הסופי בכל צינור צריך להיות 125 μl.
6. מערבלים כל צינור על מנת ליצור הומוגניות של תרחיף התא.
7. יש לדגור בחושך בטמפ' החדר למשך 45 דקות. הכינו את קוקטייל הנוגדנים החד-שבטיים (mAb) המכתים את פני השטח במהלך הדגירה בת 45 הדקות.

3. צביעת פני השטח

1. הכינו מספיק תערובת מאסטר mAb כדי להכתים את כל צינורות הניסוי. הכינו עודף של 15% מהנפח הכולל של תערובת האב הזו כדי לקחת בחשבון טעויות צנרת.
2. כוונן את עוצמת הקול של תערובת האב עם מאגר כתמים כך שיתווסף 50 μl לכל בדיקה.
3. להרחקה נאותה של תאי T שאינם CD8⁺ ותיחום תת-קבוצות זיכרון, השתמש בכמויות טיטרציה של mAbs המכוונות כנגד המולקולות הבאות בתערובת הראשית לצביעת פני השטח.
   הערה: הפלואורוכרומים המצומדים לכל mAbs מסופקים כהפניה: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 ו- CCR7 FITC. שים לב כי mAbs נגד CD14, CD16, ו- CD20 מצומדים לאותו פלואורוכרום (כלומר, BV 510) מכיוון שהם ייכללו בשער "dump".
4. כלול צבע הניתן לתיקון להבחנה בין תאים מתים בתערובת האב לצביעת פני השטח [כלומר, צבע אמין תגובתי (ARD)]. ודא כי מגיב ARD מצומד לפלואורוכרום עם ספקטרום פליטה דומה לאלה המשמשים בשער "המזבלה". במקרה זה, השתמש ב- ARD Aqua.
5. הוסף 50 μl של תערובת האב הצביעה המתוארת ב- 3.1-3.4 לצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים. בסוף שלב זה, הנפח הסופי בכל צינור צריך להיות 175 μl.
6. מערבלים כל צינור. דוגרים בחושך בטמפ' החדר למשך 25 דקות.
7. יש לשטוף תאים עם חיץ שטיפה (תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) המכילה 0.1% אלבומין בסרום בקר ו-0.45 גרם/ליטר NaN3).
   זהירות: נתרן אזיד (NaN₃) הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו לכמויות זעירות עלולה לגרום לתסמינים. יש לטפל בחומר זה בהתאם להנחיות המפורטות על ידי המשרד לבריאות ובטיחות סביבתית (EHS) במוסד שבו מבוצעים ניסויים אלה.
8. צינורות צנטריפוגות ב 510 x גרם במשך 5 דקות. בזהירות deucant supernatant לתוך מיכל פסולת נפרד. הקפד לא להפריע את הכדור.
   זהירות: אין לרוקן את חיץ השטיפה למאגרים המכילים אקונומיקה מכיוון שהוא יכול להגיב עם הנתרן אזיד הקיים במאגר השטיפה ולגרום להיווצרות גז רעיל. צור קשר עם משרד EHS במוסד שבו ניסויים אלה מבוצעים לקבלת הנחיות כיצד להיפטר מנתרן אזיד.
9. לאחר הדקאנט, מערבלים את התאים בנוזל שנותר בכל צינור.

4. קיבוע תאים

1. הוסף 250 μl של תמיסת 2% paraformaldehyde (PFA) לכל הצינורות כדי לתקן את התאים.
   אזהרה: PFA הוא חומר רעיל. חשיפה אפילו לכמויות זעירות עלולה לגרום לתסמינים. יש לטפל בחומר זה בהתאם להנחיות המפורטות על ידי משרד ה-EHS במוסד שבו מבוצעים ניסויים אלה.
   1. מכיוון שתמיסת 2% PFA חייבת להיות איזוטונית לתאים, השתמש ב- PBS להכנת תמיסה זו. מאה מיליליטר של פתרון PFA 2% מספיקים לניסויים מרובים. מערבלים ביסודיות את כל הצינורות מיד לאחר תוספת של 2% PFA על מנת למנוע היווצרות של אגרגטים תאים.
2. יש לדגור בחושך ב-4°C למשך 20 דקות.
3. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9. לאחר השלמת שלב זה, ניתן לאחסן את התאים בחושך ב -4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות. לפני שתמשיך לשלב Permeabilization, מערבל את הצינורות ביסודיות.

5. חדירות תאים

1. הוסף 500 μl של מאגר permeabilization. מערבול כל הצינורות.
2. יש לדגור בחושך בטמפ' החדר למשך 10 דקות.
3. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9.

6. צביעה תוך תאית

1. הכינו מספיק תערובת מאסטר mAb כדי להכתים את כל צינורות הניסוי.
2. כוונן את עוצמת הקול באמצעות PBS או חיץ כתמים כך שיתווסף 50 μl של תערובת האב mAb התוך-תאית בכל בדיקה.
3. הכן את תערובת האב mAb המתוארת ב- 6.1 ו- 6.2 באמצעות כמויות טיטרציה של mAbs המכוונות נגד CD3 וגרנזים B (Gzm B).
   הערה: מעורבות TCR על ידי טטרמרים pMHC-I עלולה לגרום להפנמה של CD3, מה שעלול להפריע לזיהוי תאי T טטרמר + CD3⁺ CD8⁺ אם מוסיפים את האנטי-CD3 mAb לתערובת האב של צביעת פני השטח. כדי למנוע זאת, להוסיף את אנטי CD3 mAb בשלב זה, כלומר לאחר התאים הם permeabilized. הפלואורוכרומים המצומדים לכל mAb רשומים כהפניה: CD3 PerCP Cy5.5 ו- Gzm B PE.
4. הוסף 50 μl של קוקטייל mAb לצינורות המתאימים. דוגרים בחושך בטמפ' החדר למשך 30 דקות.
5. שטפו תאים על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9. הצינורות מוכנים לרכישה בציטומטר זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דסטיניב	אקסון medchem	אקסון 1392	יש להשהות מחדש ב-DMSO ולאחסן באופן מיידי בטמפרטורה של -20°C
RPMI עם גלוטמקס	gibco/ Life Technologies	61870-036	יש לאחסן ב- 4 °C
FBS מנוטרל בחום	gibco/ Life Technologies	10082-147	יש לאחסן ב- 4 °C
פניצילין-סטרפטומיציפ-אמפוטריצין B	לונזה	17-745E	יש לאחסן ב- 4 °C
DMSO, נטול מים	לייף טכנולוגיות	D12345	יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
5-מ"ל צינורות פוליפרופילן בעלי תחתית עגולה	VWR	60819-728
טטרמרים pMHC-I מצומדים פלואורוכרום	NIH Tetramer Core או MBL, Inc.		יש לאחסן ולתחזק בטמפרטורה של 4°C. צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 15 דקות לפני השימוש. אין להקפיא.
mAbs מצומד פלואורוכרום	חברות שונות		יש לאחסן ולתחזק בטמפרטורה של 4°C. אין להקפיא.
LIVE/DEAD ערכת צביעת תאים מתים אקווה ניתנת לתיקון	לייף טכנולוגיות	L34957	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להשעות מחדש כל aliquot ב 50 μL של DMSO לפני השימוש.
מאגר כתמים מבריק	BD Biosciences	563794	יש לאחסן ב- 4 °C
פוספט חוצץ מלוחים	VWR	97064-158	יש לאחסן בטמפרטורת החדר
אלבומין בקר	VWR	700011-230	יש לאחסן ב- 4 °C
נתרן אזיד	VWR	97064-646	יש לאחסן בטמפרטורת החדר. חומר רעיל. אין לערבב עם אקונומיקה.
אקונומיקה	VWR	89501-620	כימיקל קורוזיבי, לא ניתן לערבב עם נתרן אזיד. טפל בזהירות
פרפורמאלדהיד	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15714-S	מגיב דליק, מאכל ורעיל. טפל בזהירות
פוליסורבט 20 (טווין-20)	אלפא עזר	L15029	יש לאחסן בטמפרטורת החדר
פתרון חדירה 2	BD Biosciences	340973	מגיב רעיל וקורוזיבי. טפל בזהירות
צינורות Sarsdet 1.5 מ"ל ראש בורג	VWR	72.692.005
2.0 מ"ל DNA/RNA צינורות קישור נמוך	אפנדורף	22431048	השימוש במיקרו-צינורות סטריליים הוא preffered
מערבל מערבולות
ארון בטיחות ביולוגית
מילי קיו מערכת טיהור מים אינטרגרלית	EMD Millipore	ZRXQ010WW	ניתן להשתמש במים בדרגת ביולוגיה מולקולרית מכל ספק
מיקרוצנטריפוגה
צנטריפוגה
מקרר 4°C
BD LSR II	BD Biosciences		ציטומטר זרימה חייב להכיל לייזרים ומסננים התואמים ללוח הצביעה שבו נעשה שימוש.
מים שעברו דה-יוניזציה
רדיד אלומיניום	VWR סיינטיפיק בע"מ	89068-738
אינקובטור			חייב להיות מסוגל לשמור על טמפרטורה פנימית 37 °C
תוכנת FACS Diva	BD Biosciences
תוכנת Flowjo גרסה 9.6	פלוג'ו		משמש לניתוח קבצי FCS שנוצרו על ידי תוכנת FACS Diva
טיפים Micropippette