$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תיוג פלואורסצנטי וזילוח של לויקוציטים (PMN או THP-1 עבור בני אדם ו- RAW264.7 או מונוציטים ראשוניים של עכבר עבור בדיקה מבוססת זרימה מורין)
- תיוג פלואורסצנטי
- תייגו את הלויקוציטים (1 x 10,6/מ"ל) בכתם חומצת גרעין פלואורסצנטית ירוקה (1 מיקרומטר). לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 37 ° C.
- שטפו את התאים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, והשהו תאים לריכוז של 0.5 x 106 תאים / מ"ל (5 מ"ל לכל תנאי בדיקה, בהתאם לקצב הזרימה) במאגר בדיקה.
- הכנת בדיקת תא זרימה
- להידבקות לויקוציטים על חד-שכבה תאית, השליכו את מדיום תרבית התא מהצלחת, והרכיבו אותו לתא הזרימה. חברו את הצינור למזרק. להידבקות לויקוציטים על טסיות דם משותקות, חבר את שקופית המיקרו למזרק. מראש לחמם אמבט מים ל 37 °C (77 °F).
- קח מזרק זילוח (50 מ"ל), התקן את המזרק על מחזיק המזרק, והגדר את המשאבה למצב נסיגה. הגדר את נפח המשאבה ל- 0 מ"ל והגדר את הקוטר ל- 26.70 מ"מ עבור מזרק 50 מ"ל.
- חבר מחבר פיתוי מרפק לקצה אחד של הצינור. הניחו מצמד נעילה למזרק וחברו את הצינור עם מחבר המרפק למצמד נעילת הלואר. חבר את קצה הצינור החופשי לתא הזרימה.
- זילוח לויקוציטים והדבקה
- להידבקות לויקוציטים על חד-שכבה תאית, השליכו את מדיום תרבית התא מהצלחת, והרכיבו אותו לתא הזרימה. חברו את הצינור למזרק. להידבקות לויקוציטים על טסיות דם משותקות, חבר את שקופית המיקרו למזרק.
- עבור זילוח לויקוציטים והדבקה על חד-שכבה של כלי דם או טסיות, מקם את הצינור השני לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל חיץ בדיקה וממלא את הצינור בפיפט 1 מ"ל, ולאחר מכן סחט את הצינור וחבר אותו לתא זרימה.
- לפני זילוח לויקוציטים, יש להוסיף 3 mM CaCl2 ו-2 mM MgCl2 לתרחיף התא ולדגור במשך 5 דקות ב-37°C.
- חיץ בדיקת ניקוז לפני זילוח התאים כדי להסיר אוויר אפשרי מהחדר והצינורות.
- סגירת הצינור מסתיימת על ידי לחיצתם בחוזקה והחלפת צינורות ממאגר בדיקה למתלה התא, ובכך מונעת מבועות אוויר להילכד. יש לנקב תאים עם קצב זרימה/לחץ גזירה מתאימים עד להגעת התאים הראשונים.
- פרבור תאים עם קצב זרימה/לחץ גזירה מתאים למשך 2 דקות, וצלם לפחות 6 תמונות בין 2-6 דקות של תאים מתגלגלים ודבקים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות/פלואורסצנטיות בפאזה הפוכה (לדוגמה, EVOS-FL) באמצעות הגדלה של 100X המחוברת למצלמת CCD דיגיטלית או CMOS.
הערה: קצב זרימה/לחץ גזירה תלוי במידות תא הזרימה ובצמיגות הפרפוזט. עבור תא הזילוח המשמש כאן (ראה טבלת חומרים):
τ=η*97.1*Φ
τ: מתח גזירה (1 DYN/CM2)
η: צמיגות (0.015 dyn*s/cm2)
Φ: קצב זרימה (0.67 מ"ל/דקה)
- לויקוציטים de-adhesion
- לביטול ההדבקה, החליפו את הצינור מתרחיף התא לחיץ הבודק על ידי סחיטת הצינור, ובכך מנעו מבועות אוויר להילכד.
- נתק תאים על ידי זילוח עם חיץ בדיקה עם קצב זרימה/לחץ גזירה מתאים (ראה הערה 3.3.7).
- הגירה לויקוציטים
- עבור העברת לויקוציטים, מחוררים לויקוציטים (שלב 3) עד לכמות מספקת של לויקוציטים (~ 50 תאים / שדה תצוגה).
- החלף את השעיית לויקוציטים במאגר מבחן.
- הקלט תאים נודדים על ידי קיטועי זמן כל 10-15 שניות למשך 30-60 דקות ב- 37 ° C.