$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור ננו-מבנים
- בחר כיסויי זכוכית בקוטר 25 מ"מ בעובי משוער של 170 מיקרומטר (מס' 1.5) כמצעים לננו-ייצור.
- יש לטבול את הכיסויים בתמיסת פיראנה (יחס של 3:1 בין חומצה גופרתית למי חמצן) למשך 6 שעות לפחות. שטפו את הכיסוי ספוג הפיראנה בכמויות עצומות של מים מזוקקים דה-יוניים (DDW) אולטרה-טהורים 18.2 MΩ.
זהירות: חומצת פיראנה מגיבה באלימות עם חומרים אורגניים ויש לטפל בה בזהירות רבה.
- הפקד סרט דק של כרום 10 ננומטר על הכיסויים על ידי אידוי קרן אלקטרונית כדי למנוע השפעות מטען במהלך הדפוס וההדמיה של ננו-מבנים.
- סובבו את השכבה הראשונה של התנגדות דו-שכבתית המורכבת מקופולימר אתיל לקטט מתיל מתקרילט (MMA_EL6) ב-2,000 סל"ד במשך 45 שניות ולאחר מכן אפו ב-150°C. סובבו את השכבה השנייה של פולימתיל מתקרילט (950PMMA_A2) ב-3,000 סל"ד במשך 45 שניות ואז אפו ב-180°C.
- תבנית התנגדות דו-שכבתית באמצעות ליתוגרפיית קרן אלקטרונים (EBL) ב 25 kV עם מינון שטח של 300 μC / cm2. יש לפתח איזופרופיל אלכוהול (IPA)/מתיל איזובוטיל קטון (MIBK): 2/1 ולשטוף ב-IPA.
- סרט הפקדה Ti (5 ננומטר) / Au (80 ננומטר) על המצע באמצעות מאייד קרן אלקטרונית.
- לאחר שקיעת הזהב, הרימו את ההתנגדות הדו-שכבתית הקופולימרית על ידי השריית המצע באצטון למשך 4 שעות.
- בדוק את המצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאשר את צורת וגודל ננו-מבנה, הסר את שארית הכרום מהמצע באמצעות חריטה רטובה באמצעות חריטת CR-7 למשך 60 שניות ב- RT, ולאחר מכן שטוף ב- DDW.
- תכנן מרווח מערך ממרכז למרכז של 33 מיקרומטר כדי להשאיר מקום לדימות תאי בין מערכים. עצב את הננו-מבנים בתבנית של 20 x 20 עבור כל מערך עם גובה של 300 ננומטר באמצעות כותב אלומה אלקטרונית. כל שבב מכיל 300 מערכים בעלי ממד ננומטרי טיפוסי של גובה 80±2.5 ננומטר וקוטר 70±2.5 ננומטר.
- בדוק תת-קבוצה של מערכים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) לאימות גודל ואחידות.
- חברו טבעת תמיכה, בדרך כלל סיליקון, לחלק האחורי של הכיסוי באמצעות אפוקסי מרפא UV.
2. ניקוי שבבים ויישום של Monolayer בהרכבה עצמית
- לניקוי וחידוש השבבים, אפר פלזמה בהספק של 40 W בתערובת 300 mTorr של 5% מימן, ו 95% ארגון במשך 45 שניות לאחר ניקוי התא במשך 5 דקות באותם תנאים.
- פונקציונליזציה של ננו-מבני הזהב מיד לאחר אפר פלזמה על ידי טבילת השבב בתמיסת תיול אתנולית דו-רכיבית המורכבת מיחס של 3:1 של SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) ורכיב עם קבוצה פונקציונלית אמין או קרבוקסיל, כלומר, SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) או SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- השאירו את השבב בתמיסת התיול O/N ליצירת שכבה חד-שכבתית בהרכבה עצמית (SAM).
- שוטפים את השבב באתנול ומייבשים אותו בגז חנקן.
- במידת הצורך, אחסן את השבב הפונקציונלי למשך עד שבועיים ב- 4 ° C.
- כאשר הוא מוכן לשימוש, הגיבו את רכיב SPN או SPC עם הליגנד באמצעות כימיה בהתאם לליגנד שבחרתם (ראו להלן).
הערה: ניתן לחדש את השבבים ולתפעל אותם מחדש עשרות פעמים. שבב נתון יכול לשמש לתקופות שנעות בין 6 חודשים ליותר משנה. הספקטרום הנמדד על מערך נתון משוכפל באופן אמין לאחר רגנרציות חוזרות ונשנות על ידי אפר פלזמה, ולאחר מכן ביו-פונקציונליזציה.
3. פונקציונליות פני השטח ואפיון קינטי
הערה: השתמש בשבב הפונקציונלי במכשיר SPR מסחרי כדי לאפיין את קבועי הקצב הקינטי בין הליגנד לאנליט, כמו גם כדי לחקור את ההתנגדות של SAM לקשירה לא ספציפית. יש מגוון רחב של קצבי זרימה ותכנונים מיקרופלואידים המאפשרים תפקוד יעיל של פני השטח. מכיוון שיש לנו SPR זמין מסחרית, תקננו סביב קצבי הזרימה המומלצים שלו. נציין כי קצבי זרימה אלה אופייניים לכל מכשירי SPR ולכן אינם מגבילים. מכשיר SPR אינו הכרחי מכיוון שניתן לבצע את כל הפונקציות ישירות על שבב הדמיית תהודה פלסמונית משטח מקומי (LSPR), אך הוא הפחית את עומס העבודה שלנו מכיוון שהוא מכשיר מרובב בעוד שמערך המיקרופלואידים LSPR שלנו אינו.
- פונקציונליזציה של שבב זהב חשוף מסחרי עם SAM כמתואר בסעיף 2.
- אם אתם משתמשים ב-SAM מבוסס SPC, הפעילו את קבוצת הקרבוקסיל עם תערובת של 1:1 של 133 מילימטר של 1-אתיל-3-(3-דימתיל אמינופרופיל) קרבודימיד (EDC) ו-33 מילימטר של N-הידרוקסיסוקסינימיד (NHS) ב-DDW למשך 10 דקות.
- הצמידו את קבוצת הקרבוקסיל הפעילה עם הנוגדן/ליגנד המעניין למשך 300 שניות באמצעות קצב זרימה של 30 מיקרוליטר/דקה. הכינו את הליגנדות במאגר פוספט pH 6, בדרך כלל, אך זה יכול להשתנות בהתאם למולקולה.
- לאחר צימוד הליגנד, יש להזרים אתנולמין באורך 0.1 מטר במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כשלב מנטרל למשך 300 שניות בקצב של 30 מיקרוליטר/דקה. אתנולמין מסייע במזעור הקשירה הלא ספציפית.
- הציגו את ניתוח הריבית בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר/דקה באמצעות טווח ריכוזים וחשבו את קבועי הקצב הקינטי באמצעות תוכנת ניתוח קינטית.
- אם כריכה לא ספציפית היא בעייתית, הגדל את היחס בין SPO ל- SPC או SPN.
4. הגדרות כלליות של LSPR
- הגדרות מיקרוסקופ:
- השתמש במנורת הלוגן של 100W כדי להאיר את הדגימה. השתמשו במסנן מעבר ארוך (בדרך כלל חיתוך של 593 ננומטר) בנתיב האור כדי לסלק אורכי גל שאינם תורמים לשינוי התהודה (איור 1).
- עבור איסוף הנתונים LSPRi, השתמש במיקרוסקופ הפוך עם יעד טבילת שמן 40X (1.4 NA) ומצלמת CCD 16 סיביות מקוררת תרמואלקטרית.
- מקם מפצל קרן ביציאת הפלט של המיקרוסקופ כדי לקבל תמונות וספקטרום בו זמנית.
- הגדר את שלב המיקרוסקופ מבוקר הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס ושיווי משקל למשך 4 שעות.
- שלבו מכלול דגירה נוסף במיקרוסקופ כדי לווסת את ריכוז ה-CO2 והלחות ב-5% ו-95%, בהתאמה.
- הכנת שבב והרכבה:
- פונקציונליזציה של שבב LSPR כמתואר בסעיף 2 עם יחסי SAM אופטימליים של שני רכיבים שנקבעו מניסויי SPR.
- טען את השבב בתוך מחזיק מיקרופלואיד בהתאמה אישית באופן הבא. מניחים את השבב על חתיכת תחתית אלומיניום. סנדוויץ' את השבב בין החתיכה התחתונה הזו לבין אטם סיליקון וחתיכה עליונה שקופה מפלסטיק. השתמש 4 ברגים כדי להדק את המכלול.
- עבור יישום תיול טיפוסי מבוסס SPC, מעיל טיפה 300 μl תערובת 1: 1 של 133 mM של EDC ו 33 mM של NHS ב DDW כדי להפעיל את קבוצות carboxyl של רכיב תיול SPC.
- המתן 10 דקות ושטוף ידנית את פני השטח עם PBS של 10 mM.
- הצמידו את קבוצת הקרבוקסיל הפעילה עם הליגנד (בדרך כלל נוגדן או שבר נוגדן) המעניין על ידי ציפוי טיפה של 300 מיקרוליטר של תמיסת ליגנד.
- המתן 30 דקות ושטוף ידנית עם PBS של 10 mM.
- זרוק מעיל 300 μl של 0.1 M אתנולמין ב- PBS על השבב כדי למזער קשירה לא ספציפית. המתן 10 דקות.
- שטפו את האתנולמין עם PBS המכיל 0.005% טווין 20 (PBS-T20).
- הניחו חתיכת קוורץ מעל השבב כדי להפחית תנודות בנתונים הקשורים למניסקוס משתנה.
- שמור על השבב רטוב עם חיץ PBS-T20 בעת הרכבתו על המיקרוסקופ.
- הניחו את מכלול שבב LSPR בחוזקה לתוך מחזיק דגימת הבמה המחומם וחברו צינורות מיקרופלואידים.
- חברו את צינורות המיקרופלואידיקה למכלול ולמאגר הזרימה (או מדיה נטולת סרום למחקרי תאים) עד שמגיעים למצב יציב.
- אפשרו להרכבה ולמיקרוסקופ להתאזן למשך שעתיים לפחות.
- יישרו את השבב באמצעות ג'ויסטיק כך שהמערך המרכזי מיושר עם הסיב האופטי לצורך ספקטרוסקופיה. נתונים ספקטרוסקופיים נלקחים באמצעות ספקטרומטר ותוכנת ניתוח ספקטרלי.
- שמור על מערכים ממוקדים לאורך כל הניסוי באמצעות מיקוד אוטומטי של תוכנה, Zeiss Definite Focus או התקן מיקוד אוטומטי מקביל.
5. הדמיית LSPR של הפרשות אנטי-c-myc מתאי Hybridoma 9E10
הערה: קו תאי ההיברידיומה המשמש למחקר זה מבטא נוגדנים אנטי-c-myc באופן קונסטיטוטיבי ולכן אינם דורשים טריגר כימי
- לתפקד את הננו-מבנים עם פפטיד c-myc. יש לו ערך KD של 1.77 ננומטר עבור נוגדנים anti-c-myc המופרשים על ידי תאי שיבוט 9E10 hybridoma.
- תרבית את תאי ההיברידיומה במדיום גדילה מלא עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה 1% בבקבוק T75 ב 37 ° C תחת 5% CO2. לשמור על צפיפות תאים של 4 ×105 תאים / מ"ל.
- עבור מחקרי הפרשת תאים, תאי גלולה מבקבוק T75 באמצעות צנטריפוגה, שוטפים פעמיים עם מדיה ללא סרום RPMI-1640 (SFM) כדי להסיר את הנוגדנים המופרשים ולהתאים את צפיפות התא ל 4 ×106 תאים / מ"ל.
- קצרו את התאים ובדקו את כדאיותם לפני הכנסתם לשבבי LSPR.
- הצג 50 μl של תמיסת התא באופן ידני על שבבי LSPR עם micropipette. לאחר מספר דקות, 25 עד 50 תאים נצמדים לפני השטח של שבבי LSPR.
- שטפו את התאים הנותרים בתמיסה עם SFM טרי באמצעות מערכת הזילוח המיקרופלואידית.
- בחר את מערכי LSPR עבור הדמיה קרובים, בטווח של 10 מיקרומטר, אך אינם חופפים לתאים.
- כדי להבטיח שהאות הוא ספציפי לנוגדנים האנטי-c-myc המופרשים, יש להציג את מדיית תרבית התא עם ובלי הנוגדנים הנוכחים, כמו גם עם הנוגדנים, אך עם אתרי הקישור שלהם חסומים על ידי נוכחות של ריכוז רווי של פפטיד c-myc בתמיסה.
- כייל את החיישנים בסוף כל ריצה עם תמיסה רוויה של נוגדנים anti-c-myc (250 ננומטר). זה עוזר לנרמל את התגובה של החיישנים ולקבוע תפוסה חלקית בהתבסס על פרופיל biofunctionalization של כל ריצה.
- תקן את הסטייה בכיוון X ו- Y באמצעות תוכנת יישור תמונה.
