ניתוח הקשר האנטיגני בין וירוסים באמצעות בדיקת מיקרונטרול מבוססת תמונה

Abstract

מקור: Lin, Y., et al. אופטימיזציה של בדיקת מיקרו-נטרול כמותית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את בדיקת המיקרו-נטרול מבוססת הדימות לניתוח היחסים האנטיגניים בין נגיפי שפעת A ו-B. הוא מספק דרך כמותית וויזואלית להעריך את יעילותם של נוגדנים או טיפולים אחרים במניעת זיהום ויראלי.

Protocol

1. טיטרציה וירוס

הערה: בהתאם למספר הווירוסים ומספר הכפילויות, ניתן להגדיר צלחת באר עם הגמישות הבאה: (1) ניתן לסדר את הדילול הנגיפי לאורך השורות או העמודות (איור 1). כל וירוס צריך לתפוס שורה/עמודה נפרדת. (2) תוספת הדילול הנגיפי גמישה, אך עליה להתחיל בריכוז הנגיפי הגבוה ביותר בפינה השמאלית העליונה. (3) אין הגבלה על מספר הכפילויות.

1. Aliquot מספיק תאי MDCK או תאי MDCK-SIAT8 לתוך לוחות 96 באר (200 μl / באר). לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 2 או 3 ימים כדי להגיע למפגש. להפיץ את התאים DMEM בתוספת 10% סרום עגל עובר מומת בחום (FCS) ואנטיביוטיקה (100 U/ml פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). לדגור על תאי SIAT ב 37 ° C עם 5% CO₂ ו 1 מ"ג / מ"ל G418 סולפט.
   הערה: גורם הדילול תלוי בניסיון ובקו התא בו נעשה שימוש. חד-שכבת התא חייבת להיות חופפת (כלומר, ללא דופן תא או קווי מתאר נראים לעין עבור תאי MDCK ופריסה צפופה עבור תאי MDCK-SIAT1) בזמן חיסון הנגיף. דוגמאות לדילול המבוסס על תת-תרבית של צלוחיות מפגש של תאי MDCK או MDCK-SIAT1 מוצגות בטבלה 1.
2. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 200 μl של מדיום גידול וירוס (VGM) לכל באר. יש לעקר את מכונת הכביסה מרובת הדפנות עם 70% EtOH למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותה במי מלח סטריליים חוצצי פוספט (PBS) או VGM לפני הכביסה.
3. שאפו את VGM ומיד להוסיף 50 μl של VGM לכל באר.
4. הוסף 900 μl של VGM לכל אחד מ-6 צינורות סטריליים (או פחות, בהתאם למספר וירוסי הבדיקה והכפילויות). פיפטה 100 μl של וירוס לתוך הצינור הראשון, לערבב היטב, לדלל סדרתי, לשנות את הקצוות בין כל דילול. חזור על הפעולה עבור כל וירוס כדי להיות titrated.
   הערה: זה ייתן דילול וירוס של ^10-1 עד ^10-6.
5. הוסף 50 μl מכל דילול וירוסים, החל מהדילול הגבוה ביותר (1 x 10-5 באיור 1), לבארות משוכפלות (עמודות 9 ^ו-10 באיור 1) של צלחת בת 96 בארות.
6. מניחים את הצלחת ב 37 ° C למשך 2-3 שעות כדי לאפשר לווירוס להדביק את התאים.
   הערה: יש צורך בדגירה של 2 עד 3 שעות כדי להבטיח כי לנגיפים בחיסון יש מספיק זמן להגיע למונולייה.
7. מכינים את הכיסוי (10 מ"ל/צלחת)
   הערה: הכיסוי מורכב מ-5 מ"ל של 2x DMEM, טריפסין (ריכוז סופי של 2 מק"ג/מ"ל), 20 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל מלאי, ו-5 מ"ל של חוטבי כותנה תאית (ראה רשימת חומרים).
8. הסר את החיסון.
9. הוסף את הכיסוי (200 μl לכל באר). לדגור לילה ב 37 °C, ללא הפרעה.
   הערה: ניצני הנגיף מתרחשים לאחר כ -4 שעות, ולכן חשוב כי הצלחת לא מופרע לאחר זמן זה.
10. שאפו את הכיסוי מהבארות.
11. הוסף 4% paraformaldehyde קר כקרח PBS A (200 μl/well). מניחים אותם על 4 ° C למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    הערה: PBS A הוא מלח טבעי חוצץ פוספט עם 10 גרם NaCl, 0.25 גרם KCl, 1.437 גרם של Na₂HPO₄, 0.25 גרם של KH₂PO₄, ו 1 ליטר של מים מזוקקים (ראה רשימת חומרים).
    הערה: Paraformaldehyde מזיק בשאיפה ועלול לגרום לכוויות בבליעה. יש גם עדויות מוגבלות להשפעה מסרטנת, והיא עלולה לגרום לרגישות לאחר מגע עם העור.
12. שאפו את הפרפורמלדהיד ושטפו את הצלחות פעמיים עם PBS A (200 מיקרוליטר/באר).
13. אחסנו את הצלחות ב-PBS A בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי, או המשיכו בשלבים הבאים.
14. הוסף חיץ חדירה (100 μl/well). השאירו אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
15. שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS A (200 מיקרוליטר/באר).
16. הוסף 50 μl של הנוגדן הראשון, עכבר MAb נגד שפעת סוג A (1:1,000 ב ELISA Buffer), לכל באר. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה (או 4 ° C במשך הלילה), עם רעיד.
17. שטפו אותו 3 פעמים ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה (0.05% טווין 80 ב-PBS A, v/v) לכל באר. דוגרים עליו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בין כביסה. לחלופין, לשטוף אותו 3 פעמים ללא דגירה באמצעות 300 μl לכל באר.
18. הוסף 50 μl של הנוגדן השני, עז נגד עכבר IgG (H+L) HRP מצומד (1:1,000 ב ELISA Buffer), לכל באר. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה, עם רעיד.
19. שטפו אותו 3 פעמים כמתואר בשלב 1.17.
20. מוסיפים את המצע (50 מיקרוליטר/באר). לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות או עד התפתחות של צבע כחול נראה בבירור.
21. כדי לעצור את התגובה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 200 μl של מים מזוקקים לכל באר, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2-3 דקות בין שטיפות.
22. יבשו את הצלחת באוויר ואחסנו אותה במקום חשוך (למשל, עטפו אותה ברדיד אלומיניום).

2. נטרול וירוסים

הערה: חשב את מספר הלוחות הדרושים לבדיקת הנטרול. כל צלחת יכולה להכיל וירוס אחד ומספר אנטיסרה.

הערה: בהתאם למספר האנטיסרה ומספר הכפילויות, ניתן להגדיר צלחת באר עם הגמישות הבאה: (1) ניתן לסדר את דילול הסרום לאורך שורה או עמודה (איור 2). כל סרום צריך לתפוס שורה או עמודה נפרדת. (2) התוספת של דילול הסרום היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם ריכוז הסרום הגבוה ביותר בפינה השמאלית העליונה של צלחת. (3) מספר הכפילויות מאזן את מספר האנטיסרה. כפילויות נוספות יכולות לעזור להחליק וריאציות ניסיוניות. (4) מספר ה-VC ומספר הכפילויות של פקד התא (CC) גמישים, אך עליהם להיות גם בשורות או עמודות נפרדות. צפוי כי מספר כפילויות VC גדול משמעותית מזה של antisera.

1. הכן את monolayer התא, כמו בשלבים 1.1-1.3, 2 או 3 ימים מראש.
2. הוסף 50 μl של VGM לכל באר של הצלחת.
3. השתמש בעמודות 11 ו- 12 עבור VC ו- CC, בהתאמה. הוסף 50 μl aliquots של 1:20 אנזים הורס קולטן (RDE) סרום מטופל לשורה הראשונה (A) של עמודות 1-10.
   הערה: עבור כל שילוב של וירוס וסרום, הבדיקה מבוצעת בכפילות, כך שצלחת אחת עשויה, למשל, להכיל וירוס אחד שנבדק מול חמישה אנטיסרה.
4. בצע דילול סדרתי פי 2 על-ידי העברת 50 μl משורה A לשורה H (עמודות 1-10 באיור 2) והשלכת 50 μl משורה H.
5. הוסף 50 μl של דילול לכל באר של עמודת CC (עמודה 12 באיור 2).
6. הוסף 50 μl של הנגיף לכל באר של הצלחת, למעט עמודת CC (עמודות 1-11, שורות A-H באיור 2).
7. לדגור אותו ב 37 ° C במשך 2-3 שעות. להסיר את החיסון. הוסף את הכיסוי (200 μl) לכל באר. לדגור אותו לילה ב 37 °C (77 °F), ללא הפרעה. תקן והכתים את הצלחות באשר לטיטרציה של הנגיף (שלבים 1.11-1.22).

3. נטרול כימות

1. הניחו צלחת באר באזור הסריקה של סורק שטוח, כפי שמוצג באיור 2a. השתמש במגבלת המיקום בצורת L כדי להבטיח מיקום הדמיה אופטימלי וניתן לחזור עליו.
   הערה: ניתן לצלם שתי צלחות באר בסריקה אחת.
2. סרוק את הצלחת.
3. הפעל את תוכנת "Wellplate Reader" כדי לחשב את הטיטרים הנגיפיים הנדרשים (איור 3).
   1. לחץ על הלחצן "טען תמונה" כדי לטעון תמונה. החלק את הפס האדום ב"סף גלובלי" כדי להתאים את סף הדגימה. לחץ על הלחצן "עדכן" כדי לבחון את האפקט.
   2. סמן את התיבה "חשב נטרול/טיטרציה". לחץ על כפתור "דגימה" כדי לכמת את ICP. לחץ על הלחצן "שמור" כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת.
      הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם "חישוב נטרול וטיטרציה" מופיע אוטומטית אם התיבה "חשב נטרול/טיטרציה" מסומנת.
   3. טען או הזן את מפת צלחת הבאר. ציין את הסף (למשל, 50%) ב"נטרול: ניכוי זיהום (%)".
   4. בחר "תהליך נטרול" כדי לחשב את titers. בדוק את הטיטרים ולחץ על כפתור "שמור וסגור" כדי לשמור את תוצאות הנטרול.
      הערה: נטרול מדווח כדילול הדדי של הדילול הגבוה ביותר של הסרום עם הפחתת ICP מוגדרת מראש (כגון 50% או 80%) מול VC (הממוצע של עמודה 11 באיור 4. הפחתה של 50% ב- ICP שימשה בתוצאות המייצגות.

Results

איור 1: דוגמה להתקנה של צלחת באר בניסוי טיטרציה של וירוסים. וירוסי בדיקה מוקצים לשורות נפרדות (A עד H). עמודות מיועדות לדילול ויראלי שונה (1 עד 12). שתי עמודות שימשו ככפילויות לכל דילול ויראלי. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ.

איור 2: סכמות של מערכת סרי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
VGM	סיגמא	D6429, P0781	500 מ"ל DMEM + 5 מ"ל עט/Strepb
PBS א			לחות חומצת פוספט מהטבע: NaCl 10 גרם, KCl 0.25 גרם, Na2HPO4 1.437 גרם, KH2PO4 0.25 גרם, ו-Dist. מים 1 ליטר
אביסל	FMC	RC-581F	2.4 גרם ב-100 מ"ל מים מזוקקים מומסים על ידי תסיסה על מערבל מגנטי למשך שעה. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג
2x DMEM	גיבקו	21935-028
טריפסין	סיגמא	T1426
כיסוי (10 מ"ל/צלחת):			5 מ"ל 2x DMEM, טריפסין 2 מיקרוגרם/מ"ל ריכוז סופי, Avicell 5 מ"ל
טריטון X- 100 e	סיגמא	T8787	מאגר חדירות: 0.2% ב-PBS A (v/v)
טווין 80	סיגמא	עמ' 5188	מאגר שטיפה: 0.05% Tween 80 אינץ' PBS A (v/v)
נסיוב סוסים	מעבדות PAA בע"מ	B15-021	ELISA Buffer: 10% ב-PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
עכבר MAb נגד שפעת סוג A	ביוראד	MCA 400	1 st נוגדן: 1:1,000 ב ELISA Buffer
צימוד HRP מסוג IgG נגד עכבר (H+L) נגד עכבר	ביוראד	172-1011	נוגדן שני: 1:1,000 במאגר ELISA
מצע Blu peroxidase אמיתי	KPL	50-78-02	מצע: כחול אמיתי +0.03% H2O2 גרם (1:1,000 של 30% תמיסה)
לוחות מיקרוטיטר בעלי תחתית שטוחה 96 בארות	כוכב משנה	3596
מכונת כביסה וסעפת בעלת 8 ערוצים מרובי דפנות	סיגמא	M2656
סורק צלחת שלמות	Epson	V750 Pro	ניתן להוריד את תוכנת ההדמיה באופן חופשי מחנות http://www.epson.com/cgi-bin//תמיכה/supDetail.jsp? oid=66134&infoType=הורדות.
סביבת תפעול תוכנה: LabVIEW	National Instruments Corporation	חלון מבוסס עם בונה NI Vision	גרסה: LabVIEW2012 ומעלה