1. זריעת תאים וטיפול
בהם
- תאים דבקים בתרבית 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית רקמה באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C, באמצעות מדיום התרבית המועדף עבור סוג התא המדובר. אפשרו לתאים לגדול עד שהם מגיעים לשכבת תאים כמעט מתמזגת.
הערה: השתמש Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) עבור LNCaP, HEK293, פיברובלסטים עובריים עכבר (MEFs), BJ, MCF-7, ו RPE-1 תאים.
- לשטוף את התאים עם 3 מ"ל 37 ° C פוספט buffered מלוחים (PBS), pH 7.4. החלף את PBS עם 3 מ"ל 0.25% (w/v) טריפסין-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), ודגור את הבקבוק באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C עד שהתאים מתנתקים (2-5 דקות).
- השהה מחדש את התאים המנותקים עם מדיום תרבית 7 מ"ל המכיל 10% FBS. ערבבו אליקוט תרחיף תא 10 μL עם 10 μL 0.4% Trypan Blue בצינור מיקרוצנטריפוגה, באמצעות קצה פיפטה 0.5-20 μL. השתמש באותו קצה פיפטה כדי למלא מיד שקופית של תא ספירה, וספור את התאים במונה תאים אוטומטי.
- הכינו דילול מתאים (ראה הערה להלן) של תרחיף התא משלב 1.1.2 באמצעות מדיום תרבית המכיל 10% FBS, וזרע 1 מ"ל של תרחיף התא המדולל בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 12 בארות (שטח פנים ~ 3.8 ס"מ2) בטכניקה אספטית. אפשר צמיחה באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C עד לצפיפות התאים הרצויה, למשל, 60-90% מפגש בעת הקציר.
הערה: הדילול המתאים של תרחיף התא שייתן את מפגש התאים הרצוי בעת הקציר ישתנה מסוג התא לסוג התא, וכן בהתאם למשך וסוג הטיפולים הניסיוניים. לפיכך, יש להעריך זאת אמפירית בכל מקרה.
- עבור ניסויים שיש לטפל בהם ולקצור אותם יומיים לאחר הזריעה, זרעו 2.5 x 105 תאי LNCaP, HEK293 או MCF-7, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ, או 1.5 x 105 RPE-1 תאים בכל באר של צלחת 12 בארות.
- עבור תאים הנצמדים באופן רופף, צפו את הצלחות בסוג הציפוי המומלץ לסוג התא המדובר. עבור LNCaP (ו- HEK293) תאים להשתמש לוחות מצופים poly-D-ליזין (PDL).
- לשם כך, יש להוסיף 500 μL PDL ב-2.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O סטרילי לכל באר, ולדגור על הצלחות בסביבה סטרילית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס). מוציאים את ה-PDL עם יניקה, ושוטפים היטב בקצרה עם 1 מ"ל סטרילי H2O.
הערה: בדרך כלל, שלב 1.2.1 נעשה ללא כל טיפולים ניסיוניים. עם זאת, אם מבצעים RNAi, זה עשוי להיות נוח להתחיל transfection הפוך עם הזריעה.
- בצע טיפולים ניסיוניים בבארות כפולות או משולשות לכל מצב.
- לדוגמה, טפל בתאים עם 50 ננומטר של מעכב mTOR Torin1, אשר בדרך כלל מהווה גורם יעיל לקיבוע אוטופגי, או חשוף את התאים לרעב חריף בסרום ובחומצות אמינו על ידי שטיפת התאים עם 1 מ"ל של מדיום תמיסת מלח מאוזנת (EBSS) ללא חומצות אמינו, ולאחר מכן לדגור על התאים ב -1 מ"ל של EBSS באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני (CO2) ב -37 מעלות צלזיוס.
- השאירו קבוצה אחת של בארות לא מטופלות על מנת להגדיר רמות רקע של דהידרוגנאז לקטט משקע (LDH).
- הוסף כמות רוויה של מעכב לאחר sequestration bafilomycin A1 (Baf) בהיעדר או נוכחות של טיפולים ניסיוניים, 3-4 שעות לפני קציר התא. לדגור את התאים באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C.
- השתמש ב- 100 nM Baf עבור תאי LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 ו- RPE-1, וב- 10 nM Baf עבור MEFs.
- עבור טיפולים ניסיוניים שיש להם משך של 3-4 שעות בלבד (כמו אלה שהודגמו בשלב 1.3.1 בדרך כלל), להוסיף Baf במקביל לטיפולים. לטיפולים ניסיוניים ארוכים יותר, המתינו עד 3-4 שעות לפני הקציר, והוסיפו 2 מיקרוליטר של ציר Baf מרוכז פי 500 ישירות למדיום.
- מערבבים על ידי התסיסה את הצלחת מיד לאחר הוספת באף. בשלב זה, מומלץ גם להוסיף מעכבי קיבוע מקרואוטופגיים כבקרות, למשל, 10 מילימטר של מעכב פאן-פוספואינסיטיד 3-קינאז (PI3K) 3-מתיל אדנין (3MA), או 10 מיקרומטר של מעכב PI3K Class III סלקטיבי SAR-405.
2. קציר תאים והכנה לאלקטרודיסטריבציה
- בתום תקופת הטיפול, שאפו את המדיום עם יניקה והוסיפו תמיסת ניתוק תאים של 200 μL (מחוממת מראש ל-37°C) לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתנתקים (בדרך כלל בסביבות 5 דקות).
הערה: בעוד 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA ניתן להשתמש במקום פתרון ניתוק התא, האחרון מכיל DNase, אשר מסייע להפחית את צמיגות התאים מנותקים. כל עוד המדיום הוא שואף היטב, אין צורך לשטוף את התאים לפני תוספת של טריפסין-EDTA או תמיסת ניתוק תאים.
- הוסף 500 μL טמפרטורת החדר (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, המכיל 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל באר, והשהה מחדש עם פיפטה עד שלא נראים גושי תאים. מיד להעביר את השעיית התא 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge על קרח.
הערה: אלא אם כן צוין אחרת, בצע את כל השלבים הבאים על קרח.
- משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- שאפו היטב את הסופרנאטנט (עם יניקה) להשאיר את כדורי התא יבשים ככל האפשר.
- הוסף 400 μL 10% (w/v) סוכרוז (ב H2O טהור במיוחד) לכל צינור.
3. אלקטרודיסטריבציה של קרום הפלזמה והפרדת שברים של תאים סדימנטריים וטוטאליים
- השהה מחדש את גלולת התא עם פיפטה כדי לקבל השעיה כמעט חד תאית, ולהעביר אותו לקובט אלקטרופורציה 4 מ"מ.
הערה: פיפטינג למעלה ולמטה ~ 10-15 פעמים, באמצעות קצה פיפטה 100-1,000 μL, הוא בדרך כלל מספיק.
- מקם את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה מעריכי, ופרוק פולס חשמלי יחיד ב 800 V, 25 μF ו 400 Ω; הגדרות אלה מייצרות פולס של ~ 8 אלפיות השנייה.
- השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר את הפרעה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 400 μL תמיסת סוכרוז חוצצת פוספט קרה כקרח (100 mM נתרן מונופוספט, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA, ו 1.75% סוכרוז, pH 7.5), וערבב לזמן קצר על ידי pipetting.
- אופציונלי: כדי לוודא הפרעה חשמלית יעילה של קרום הפלזמה, ערבבו 10 μL של התא המדולל מרגע 3.3 עם 10 μL 0.4% Trypan Blue בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. מעבירים לתא ספירה ומוודאים שאחוז התאים החיוביים בכחול טריפאן הוא >99%.
- השאירו את הדגימה בתא הספירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס), וודאו שאחוז התאים החיוביים של טריפאן בלו נשאר >99%.
- אופציונלי: כדי לוודא שההפרעה החשמלית לא הייתה קשה מדי, כלומר, היא לא שיבשה אברונים תוך תאיים, בצע את שלבים 1.1-3.3 כמתואר לעיל, אך השתמש בחומר מוצא גדול יותר (באר מצלחת 6 בארות עם שכבת תאים מתמזגת ~80%), והשתמש בתמיסת סוכרוז חוצצת פוספט 150 μL 10% בשלב 2.5 ו- 150 μL פוספט ללא DTT בשלב 3.3.
- השתמש בפיפטה כדי לשכב בזהירות 200 μL של תמיסת משבש התא המדולל על גבי כרית צפיפות של 1.2 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות חוצץ פוספט 8% (w/v) (למשל, 8% Nycodenz, 50 mM נתרן פוספט, 2.2% סוכרוז, 1 mM EDTA) בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C במיקרוצנטריפוגה עם פונקציה במצב רך (להאצה והאטה עדינות), בזהירות לשים את הצינורות על קרח.
- הסר בזהירות 60 μL מהחלק העליון ~ 200 μL, הקפד לא להרים שום תמיסת מדיום שיפוע צפיפות, והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
הערה: זה צריך להכיל cytosol של טוהר יוצא דופן, המכונה "לשד התא".
- בדוק את טוהר השבר המתקבל בשלב הנ"ל, על ידי ביצוע ניתוחי כתמים מערביים של חלבונים המכילים אברונים, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות וג'ל שיפוע של 4-20%.
- בצע לדוגמה immunoblotting עבור cathepsin B, cytochrome c, ואיזומראז דיסולפיד חלבון, כדי לוודא כי השוק החשמלי בשלב 3.2 לא שיבש ליזוזומים, מיטוכונדריה, או רשתית אנדופלסמית, בהתאמה, ו immunoblot עבור LDH כדי לאמת את נוכחותו של חלבון cytosolic בלשד התא.
- במקביל, בצעו אימונובלוטציה על תמציות חלבונים העשויות מתמיסת שיבוש התא הכוללת כדי לאשר שהנוגדנים המשמשים יכולים לזהות את החלבונים המכילים אברונים שנבדקים.
- חזור על שלבים 3.1-3.3 עבור כל דגימה.
- יש להסיר 550 μL מכל תמיסת משבש תאים מדוללת (המתקבלת בשלב 3.3) ל-2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות 900 μL חוצץ מתלה קר כקרח (50 mM נתרן מונופוספט, 1 mM DTT, 1 mM EDTA ו-5.9% סוכרוז, pH 7.5) בתוספת 0.5% BSA ו-0.01% Tween-20, ולערבב לזמן קצר באמצעות פיפט.
- צנטריפוגה ב 18,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C כדי לייצר כדורים המכילים "LDH משקעים". שאפו היטב את הסופרנאטנט (עם יניקה) להשאיר את הכדוריות יבשות ככל האפשר. הכניסו את הדגימות למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
- מעבירים 150 μL מכל תמיסת משבש תאים מדוללת (המתקבלת בשלב 3.3) לצינורות חדשים, ומניחים את הדגימות במקפיא של -80°C. השתמש בדגימות אלה כדי לקבוע את רמות "LDH הכולל" בתאים.
הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי כל עוד רוצים.
4. מיצוי LDH ומדידה של פעילות אנזימטית LDH
- הפשירו את דגימות "ה-LDH המשוקע" (משלב 3.6) ואת דגימות "סך כל ה-LDH" (משלב 3.7) על קרח.
- הוסף 300 μL של חיץ מתלה קר כקרח המכיל 1.5% Triton X-405 לדגימות "סך LDH" (והניב ריכוז סופי של Triton X-405 של 1%). סובבו את הדגימות על רולר בחדר קר (4-8 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
- הוסף 750 μL של חיץ מתלה קר כקרח עם 1% Triton X-405 לדגימות "LDH משקע", והשהה מחדש את הכדוריות עם פיפטה עד שתגיע לפתרון הומוגני.
- צנטריפוגו את הדגימות משלבים 4.2 ו-4.3 בטמפרטורה של 18,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C כדי לקבע פסולת תאית בלתי מומסת.
- יש לערבב 4 חלקים של אימידזול קר 65 mM (pH 7.5)/0.75 mM פירובט עם חלק אחד של NADH קר 65 mM imidazole (pH 7.5)/1.8 mM NADH כדי לקבל פתרון עבודה יציב למשך שלושה שבועות לפחות ב-4°C.
- ערבבו 3-30 מיקרוליטר של הסופרנאטנטים משלב 4.4 עם 200 מיקרוליטר של תמיסת העבודה שלב 4.5.
- קבע את כמות LDH על ידי מדידת הפעילות האנזימטית של LDH כירידה בספיגת ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד (צורה מופחתת) (NADH) ב-340 ננומטר ב-37°C בהשוואה לתקן עם ריכוז LDH ידוע. בצעו מדידות ספיגה עד שהתגובה מתקרבת להשלמתה, כלומר עד שהספיגה ב-340 ננומטר כבר לא משתנה עם הזמן.
הערה: זוהי השיטה הביוכימית הקלאסית למדידת פעילות LDH. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מבצע את התגובה ב -37 מעלות צלזיוס, ניתן לבצע אותה גם בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס), וזה מומלץ אם עושים ספקטרופוטומטריה ידנית. הפרוטוקול הנוכחי משתמש במכשיר רובוטי רב-אנלייזר, אשר באופן אוטומטי מערבב דגימות עם פתרון עבודה בצלחת 96 בארות, ומודד את הספיגה ב 340 ננומטר ב 37 ° C כל 20 שניות במשך 3 דקות. לאחר מכן, תוכנת המכשיר מחשבת את ריכוז LDH, מבוטא כיחידות (U)/L, על ידי השוואת שיפוע מדידות הספיגה לאורך זמן בהשוואה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות כיול עם תקן של ריכוז LDH ידוע. טווח הגילוי הליניארי בגישה זו הוא 30-1,500 U/L. כחלופה, קיים מגוון רחב של ערכות זמינות מסחרית למדידת LDH. חלקם מבוססים על צימוד התגובה האנזימטית ליצירת תוצרים קולורימטריים או פלואורסצנטיים, המאפשרים גילוי באמצעים אחרים מלבד ספקטרופוטומטריה UV, ועם טווחי גילוי ליניאריים אחרים.
