כימות פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים

תקציר

מקור: Luhr, M. et al., The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים בדיקה להערכת פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים. הוא משתמש באלקטרופורציה כדי לשחרר חלבונים ציטוסוליים, כולל לקטט דהידרוגנאז (LDH). שברי ה-LDH המבודדים וה-LDH התאי הכולל נקבעים כדי להעריך את תפיסת ה-LDH, ומספקים תובנות לגבי הפעילות הכוללת של קיבוע בתפזורת.

פרוטוקול

1. זריעת תאים וטיפול

בהם

1. תאים דבקים בתרבית 75 ס"מ² צלוחיות תרבית רקמה באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C, באמצעות מדיום התרבית המועדף עבור סוג התא המדובר. אפשרו לתאים לגדול עד שהם מגיעים לשכבת תאים כמעט מתמזגת.
   הערה: השתמש Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) עבור LNCaP, HEK293, פיברובלסטים עובריים עכבר (MEFs), BJ, MCF-7, ו RPE-1 תאים.
   1. לשטוף את התאים עם 3 מ"ל 37 ° C פוספט buffered מלוחים (PBS), pH 7.4. החלף את PBS עם 3 מ"ל 0.25% (w/v) טריפסין-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), ודגור את הבקבוק באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C עד שהתאים מתנתקים (2-5 דקות).
   2. השהה מחדש את התאים המנותקים עם מדיום תרבית 7 מ"ל המכיל 10% FBS. ערבבו אליקוט תרחיף תא 10 μL עם 10 μL 0.4% Trypan Blue בצינור מיקרוצנטריפוגה, באמצעות קצה פיפטה 0.5-20 μL. השתמש באותו קצה פיפטה כדי למלא מיד שקופית של תא ספירה, וספור את התאים במונה תאים אוטומטי.
2. הכינו דילול מתאים (ראה הערה להלן) של תרחיף התא משלב 1.1.2 באמצעות מדיום תרבית המכיל 10% FBS, וזרע 1 מ"ל של תרחיף התא המדולל בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 12 בארות (שטח פנים ~ 3.8 ס"מ²) בטכניקה אספטית. אפשר צמיחה באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C עד לצפיפות התאים הרצויה, למשל, 60-90% מפגש בעת הקציר.
   הערה: הדילול המתאים של תרחיף התא שייתן את מפגש התאים הרצוי בעת הקציר ישתנה מסוג התא לסוג התא, וכן בהתאם למשך וסוג הטיפולים הניסיוניים. לפיכך, יש להעריך זאת אמפירית בכל מקרה.
   1. עבור ניסויים שיש לטפל בהם ולקצור אותם יומיים לאחר הזריעה, זרעו 2.5 x 10⁵ תאי LNCaP, HEK293 או MCF-7, 5 x 10⁴ MEFs, 4 x 10⁵ BJ, או 1.5 x 10⁵ RPE-1 תאים בכל באר של צלחת 12 בארות.
   2. עבור תאים הנצמדים באופן רופף, צפו את הצלחות בסוג הציפוי המומלץ לסוג התא המדובר. עבור LNCaP (ו- HEK293) תאים להשתמש לוחות מצופים poly-D-ליזין (PDL).
   3. לשם כך, יש להוסיף 500 μL PDL ב-2.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H₂O סטרילי לכל באר, ולדגור על הצלחות בסביבה סטרילית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס). מוציאים את ה-PDL עם יניקה, ושוטפים היטב בקצרה עם 1 מ"ל סטרילי H₂O.
      הערה: בדרך כלל, שלב 1.2.1 נעשה ללא כל טיפולים ניסיוניים. עם זאת, אם מבצעים RNAi, זה עשוי להיות נוח להתחיל transfection הפוך עם הזריעה.
3. בצע טיפולים ניסיוניים בבארות כפולות או משולשות לכל מצב.
   1. לדוגמה, טפל בתאים עם 50 ננומטר של מעכב mTOR Torin1, אשר בדרך כלל מהווה גורם יעיל לקיבוע אוטופגי, או חשוף את התאים לרעב חריף בסרום ובחומצות אמינו על ידי שטיפת התאים עם 1 מ"ל של מדיום תמיסת מלח מאוזנת (EBSS) ללא חומצות אמינו, ולאחר מכן לדגור על התאים ב -1 מ"ל של EBSS באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני (CO₂) ב -37 מעלות צלזיוס.
   2. השאירו קבוצה אחת של בארות לא מטופלות על מנת להגדיר רמות רקע של דהידרוגנאז לקטט משקע (LDH).
   3. הוסף כמות רוויה של מעכב לאחר sequestration bafilomycin A1 (Baf) בהיעדר או נוכחות של טיפולים ניסיוניים, 3-4 שעות לפני קציר התא. לדגור את התאים באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C.
      1. השתמש ב- 100 nM Baf עבור תאי LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 ו- RPE-1, וב- 10 nM Baf עבור MEFs.
      2. עבור טיפולים ניסיוניים שיש להם משך של 3-4 שעות בלבד (כמו אלה שהודגמו בשלב 1.3.1 בדרך כלל), להוסיף Baf במקביל לטיפולים. לטיפולים ניסיוניים ארוכים יותר, המתינו עד 3-4 שעות לפני הקציר, והוסיפו 2 מיקרוליטר של ציר Baf מרוכז פי 500 ישירות למדיום.
      3. מערבבים על ידי התסיסה את הצלחת מיד לאחר הוספת באף. בשלב זה, מומלץ גם להוסיף מעכבי קיבוע מקרואוטופגיים כבקרות, למשל, 10 מילימטר של מעכב פאן-פוספואינסיטיד 3-קינאז (PI3K) 3-מתיל אדנין (3MA), או 10 מיקרומטר של מעכב PI3K Class III סלקטיבי SAR-405.

2. קציר תאים והכנה לאלקטרודיסטריבציה

1. בתום תקופת הטיפול, שאפו את המדיום עם יניקה והוסיפו תמיסת ניתוק תאים של 200 μL (מחוממת מראש ל-37°C) לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתנתקים (בדרך כלל בסביבות 5 דקות).
   הערה: בעוד 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA ניתן להשתמש במקום פתרון ניתוק התא, האחרון מכיל DNase, אשר מסייע להפחית את צמיגות התאים מנותקים. כל עוד המדיום הוא שואף היטב, אין צורך לשטוף את התאים לפני תוספת של טריפסין-EDTA או תמיסת ניתוק תאים.
2. הוסף 500 μL טמפרטורת החדר (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, המכיל 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל באר, והשהה מחדש עם פיפטה עד שלא נראים גושי תאים. מיד להעביר את השעיית התא 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge על קרח.
   הערה: אלא אם כן צוין אחרת, בצע את כל השלבים הבאים על קרח.
3. משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. שאפו היטב את הסופרנאטנט (עם יניקה) להשאיר את כדורי התא יבשים ככל האפשר.
5. הוסף 400 μL 10% (w/v) סוכרוז (ב H₂O טהור במיוחד) לכל צינור.

3. אלקטרודיסטריבציה של קרום הפלזמה והפרדת שברים של תאים סדימנטריים וטוטאליים

1. השהה מחדש את גלולת התא עם פיפטה כדי לקבל השעיה כמעט חד תאית, ולהעביר אותו לקובט אלקטרופורציה 4 מ"מ.
   הערה: פיפטינג למעלה ולמטה ~ 10-15 פעמים, באמצעות קצה פיפטה 100-1,000 μL, הוא בדרך כלל מספיק.
2. מקם את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה מעריכי, ופרוק פולס חשמלי יחיד ב 800 V, 25 μF ו 400 Ω; הגדרות אלה מייצרות פולס של ~ 8 אלפיות השנייה.
3. השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר את הפרעה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 400 μL תמיסת סוכרוז חוצצת פוספט קרה כקרח (100 mM נתרן מונופוספט, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA, ו 1.75% סוכרוז, pH 7.5), וערבב לזמן קצר על ידי pipetting.
   1. אופציונלי: כדי לוודא הפרעה חשמלית יעילה של קרום הפלזמה, ערבבו 10 μL של התא המדולל מרגע 3.3 עם 10 μL 0.4% Trypan Blue בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. מעבירים לתא ספירה ומוודאים שאחוז התאים החיוביים בכחול טריפאן הוא >99%.
      1. השאירו את הדגימה בתא הספירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס), וודאו שאחוז התאים החיוביים של טריפאן בלו נשאר >99%.
   2. אופציונלי: כדי לוודא שההפרעה החשמלית לא הייתה קשה מדי, כלומר, היא לא שיבשה אברונים תוך תאיים, בצע את שלבים 1.1-3.3 כמתואר לעיל, אך השתמש בחומר מוצא גדול יותר (באר מצלחת 6 בארות עם שכבת תאים מתמזגת ~80%), והשתמש בתמיסת סוכרוז חוצצת פוספט 150 μL 10% בשלב 2.5 ו- 150 μL פוספט ללא DTT בשלב 3.3.
      1. השתמש בפיפטה כדי לשכב בזהירות 200 μL של תמיסת משבש התא המדולל על גבי כרית צפיפות של 1.2 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות חוצץ פוספט 8% (w/v) (למשל, 8% Nycodenz, 50 mM נתרן פוספט, 2.2% סוכרוז, 1 mM EDTA) בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C במיקרוצנטריפוגה עם פונקציה במצב רך (להאצה והאטה עדינות), בזהירות לשים את הצינורות על קרח.
      2. הסר בזהירות 60 μL מהחלק העליון ~ 200 μL, הקפד לא להרים שום תמיסת מדיום שיפוע צפיפות, והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
         הערה: זה צריך להכיל cytosol של טוהר יוצא דופן, המכונה "לשד התא".
      3. בדוק את טוהר השבר המתקבל בשלב הנ"ל, על ידי ביצוע ניתוחי כתמים מערביים של חלבונים המכילים אברונים, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות וג'ל שיפוע של 4-20%.
      4. בצע לדוגמה immunoblotting עבור cathepsin B, cytochrome c, ואיזומראז דיסולפיד חלבון, כדי לוודא כי השוק החשמלי בשלב 3.2 לא שיבש ליזוזומים, מיטוכונדריה, או רשתית אנדופלסמית, בהתאמה, ו immunoblot עבור LDH כדי לאמת את נוכחותו של חלבון cytosolic בלשד התא.
      5. במקביל, בצעו אימונובלוטציה על תמציות חלבונים העשויות מתמיסת שיבוש התא הכוללת כדי לאשר שהנוגדנים המשמשים יכולים לזהות את החלבונים המכילים אברונים שנבדקים.
4. חזור על שלבים 3.1-3.3 עבור כל דגימה.
5. יש להסיר 550 μL מכל תמיסת משבש תאים מדוללת (המתקבלת בשלב 3.3) ל-2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות 900 μL חוצץ מתלה קר כקרח (50 mM נתרן מונופוספט, 1 mM DTT, 1 mM EDTA ו-5.9% סוכרוז, pH 7.5) בתוספת 0.5% BSA ו-0.01% Tween-20, ולערבב לזמן קצר באמצעות פיפט.
6. צנטריפוגה ב 18,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C כדי לייצר כדורים המכילים "LDH משקעים". שאפו היטב את הסופרנאטנט (עם יניקה) להשאיר את הכדוריות יבשות ככל האפשר. הכניסו את הדגימות למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
7. מעבירים 150 μL מכל תמיסת משבש תאים מדוללת (המתקבלת בשלב 3.3) לצינורות חדשים, ומניחים את הדגימות במקפיא של -80°C. השתמש בדגימות אלה כדי לקבוע את רמות "LDH הכולל" בתאים.
   הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי כל עוד רוצים.

4. מיצוי LDH ומדידה של פעילות אנזימטית LDH

1. הפשירו את דגימות "ה-LDH המשוקע" (משלב 3.6) ואת דגימות "סך כל ה-LDH" (משלב 3.7) על קרח.
2. הוסף 300 μL של חיץ מתלה קר כקרח המכיל 1.5% Triton X-405 לדגימות "סך LDH" (והניב ריכוז סופי של Triton X-405 של 1%). סובבו את הדגימות על רולר בחדר קר (4-8 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
3. הוסף 750 μL של חיץ מתלה קר כקרח עם 1% Triton X-405 לדגימות "LDH משקע", והשהה מחדש את הכדוריות עם פיפטה עד שתגיע לפתרון הומוגני.
4. צנטריפוגו את הדגימות משלבים 4.2 ו-4.3 בטמפרטורה של 18,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C כדי לקבע פסולת תאית בלתי מומסת.
5. יש לערבב 4 חלקים של אימידזול קר 65 mM (pH 7.5)/0.75 mM פירובט עם חלק אחד של NADH קר 65 mM imidazole (pH 7.5)/1.8 mM NADH כדי לקבל פתרון עבודה יציב למשך שלושה שבועות לפחות ב-4°C.
6. ערבבו 3-30 מיקרוליטר של הסופרנאטנטים משלב 4.4 עם 200 מיקרוליטר של תמיסת העבודה שלב 4.5.
7. קבע את כמות LDH על ידי מדידת הפעילות האנזימטית של LDH כירידה בספיגת ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד (צורה מופחתת) (NADH) ב-340 ננומטר ב-37°C בהשוואה לתקן עם ריכוז LDH ידוע. בצעו מדידות ספיגה עד שהתגובה מתקרבת להשלמתה, כלומר עד שהספיגה ב-340 ננומטר כבר לא משתנה עם הזמן.
   הערה: זוהי השיטה הביוכימית הקלאסית למדידת פעילות LDH. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מבצע את התגובה ב -37 מעלות צלזיוס, ניתן לבצע אותה גם בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס), וזה מומלץ אם עושים ספקטרופוטומטריה ידנית. הפרוטוקול הנוכחי משתמש במכשיר רובוטי רב-אנלייזר, אשר באופן אוטומטי מערבב דגימות עם פתרון עבודה בצלחת 96 בארות, ומודד את הספיגה ב 340 ננומטר ב 37 ° C כל 20 שניות במשך 3 דקות. לאחר מכן, תוכנת המכשיר מחשבת את ריכוז LDH, מבוטא כיחידות (U)/L, על ידי השוואת שיפוע מדידות הספיגה לאורך זמן בהשוואה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות כיול עם תקן של ריכוז LDH ידוע. טווח הגילוי הליניארי בגישה זו הוא 30-1,500 U/L. כחלופה, קיים מגוון רחב של ערכות זמינות מסחרית למדידת LDH. חלקם מבוססים על צימוד התגובה האנזימטית ליצירת תוצרים קולורימטריים או פלואורסצנטיים, המאפשרים גילוי באמצעים אחרים מלבד ספקטרופוטומטריה UV, ועם טווחי גילוי ליניאריים אחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל ו-2 מ"ל	אפנדורף	211-2130 ו-211-2120
צלחות 12 בארות	בז	353043
פתרון ניתוק תאי Accumax	טכנולוגיות תאים חדשניות	A7089	שמור aliquots ב -20 ° C במשך שנים, ובמקרר במשך כמה חודשים
Bafilomycin A1	אנזו	BML-CM110-0100	להתמוסס ב-DMSO
תאי BJ	ATCC	CRL-2522	לשימוש במעבר <30
אלבומין בסרום בקר (BSA)	VWR	422361V
תא ספירה בורקר	פישר סיינטיפיק	139-658585
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת	ThermoFisher Scientfic	C10228
מונה תאים אוטומטי של הרוזנת השנייה	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
כיסוי זכוכית לתא הספירה Burker	פישר סיינטיפיק	139-658586
קריטריון Tris-HCl ג'ל, 4-20%, 26-well, 15 μl, 13.3 x 8.7 ס"מ (W x L)	ביו-ראד	3450034
DTT	סיגמא-אולדריץ'	D0632
תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS)	גיבקו	24010-043	קונטינים 0.1% גלוקוז
EDTA	סיגמא-אולדריץ'	E7889
קובטת אלקטרופורציה (4 מ"מ)	ביו-ראד	1652088
אלקטרופורטור גל דעיכה מעריכית	BTX מכשיר הרווארד	EMC 630
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא	F7524	10% ריכוז סופי בסל"ד 1640 בינוני
תאי HEK293	ATCC	CRL-1573
אימידזול	סיגמא-אולדריץ'	56750	Autoclave פתרון 65 mM ולשמור במקרר במשך חודשים
אינקובטור; אינקובטור CO2 Autoflow IR Direct Heat	נואיר	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX מגיב טרנספקציה	תרמופישר	13778150
תאי LNCaP	ATCC	CRL-1740	לשימוש במעבר <30
3-מתיל אדנין (3MA)	סיגמא-אולדריץ'	M9281	מלאי 100 מ"מ בסל"ד ב-20°C-. יש לחמם את המלאי ל-65°C למשך 10 דקות, ולהשתמש בריכוז סופי של 10°C
מיקרוצנטריפוגה בקירור	בקמן קולטר מדעי החיים	368831
מיקרוצנטריפוגה בקירור עם פונקציית מצב רך	אפנדורף	אפנדורף 5417R
MRT67307 הידרוכלוריד (ULKi)	סיגמא-אולדריץ'	SML0702	מעכב את פעילות ULK קינאז. להתמוסס ב-DMSO.
מכשיר MaxMat Multianalyzer	ארבה דיאגנוסטיקה	PL-II
תאי MCF7	ATCC	HTB-22
NADH	מרק-מיליפור	1.24644.001
ניקודנץ	מגן ציר	1002424
Opti-MEM סרום מופחת בינוני	תרמופישר	31985062
מלח חוצץ פוספט (PBS)	גיבקו	20012-019
טיפים פיפטה 3 (0.5-20 μl)	VWR	732-2223	טיפים למחסום Thermo Fischer ART
קצוות פיפטה (1-200 מיקרוליטר)	VWR	732-2207	טיפים למחסום Thermo Fischer ART
קצוות פיפטה (100-1000μl)	VWR	732-2355	טיפים למחסום Thermo Fischer ART
פיפטות	תרמופישר	4701070	ערכת Finnpipette F2 GLP
פולי-די-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	P6407-10X5MG	הכינו תמיסת ציר של 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O סטרילי. פתרון זה יציב ב -20 °C למשך שנה אחת לפחות.
פירובט	מרק-מיליפור	1066190050
תאי RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	גיבקו	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	מעכב phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). להתמוסס ב-DMSO.
משתיק קול בחר שליטה שלילית #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
משתיק קול בחר siRNA ממוקד ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	S35504
משתיק קול בחר siRNA ממוקד FIP200 (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
משתיק קול בחר siRNA ממוקד ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
משתיק קול בחר siRNA ממוקד ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	S22362
משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAPL1 (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	S24333
משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAPL2 (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
נתרן פוספט מונובייסיק דיהידרט (NaH2PO4 • 2H2O)	מרק-מיליפור	1.06580.1000
נתרן פוספט דיבייסיק דיהידראט (Na2HPO4 • 2H2O )	פרולאבו	28014.291
סוכרוז	VWR	443816T	10% ריכוז סופי במים; מסננים דרך מסנן 0.45 מיקרומטר ושומרים במקרר למשך חודשים
תאפסיגרגין	סיגמא-אולדריץ'	T9033	מעכב את משאבת SERCA ER Ca2+. להתמוסס ב-DMSO.
טריטון X-405	סיגמא-אולדריץ'	X405	1% סופי
טריפאן כתם כחול 0.4%	בדיקות מולקולריות	T10282
טריפסין-EDTA (0.25% עם טריפסין)	גיבקו	25200-056
טווין-20	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 2287	0.01% סופי