1. תנאי תרבית לחלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)
הערה: זן האוקסוטרופ M. tuberculosis H37Rv נגזר mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) שעבר טרנספורמציה עם gfp (חלבון פלואורסצנטי ירוק) המבטא פלסמיד pMN437 משמש לאורך פרוטוקול זה. ניתן להחליף את זן Mtb-GFP בזן שאינו GFP המבטא זן פראי כדי לאפשר נגישות קלה יותר של הזן לחוקרים. עם זאת, ביטוי gfp רצוי כדי לאפשר אישור חזותי של phagocytosis והיווצרות של אגרגטים Mtb/מקרופאגים. לאחסון לטווח ארוך, Mtb-GFP הוקפאו בטמפרטורה של -80°C במדיה מלאה של 7H9 (המתוארת בשלב 1.1) בתוספת 20% גליצרול.
- הכן מדיית Mtb-GFP מלאה (7H9-C) על ידי תוספת בינונית 7H9 עם 10% Middlebrook OADC (אולאית אלבומין דקסטרוז קטלאז), 0.02% טילוקספול, 24 מיקרוגרם/מ"ל D-חומצה פנטותנית, 50 מיקרוגרם/מ"ל L-לאוצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין B.
- הפשירו בקבוקון אחד של Mtb-GFP והוסיפו 10 מ"ל של 7H9-C בבקבוק PETG תחתון מרובע של 30 מ"ל.
- יש לדגור ב-37°C על שייקר סיבובי (50 סל"ד). בצע מדידות צפיפות אופטית (OD600) כל כמה ימים עד ש-OD600 יגיע ל-1.0 (כ-5-8 ימים).
- לדלל ולהעביר תרבית לפי הצורך כדי לשמור על OD600 בין 0.2-1.0.
- עבור זיהום, השתמש בתרבית מבוססת של Mtb-GFP בשלב הגידול הלוגריתמי (OD600 של 0.6-1). כדי להימנע מתרביות גושיות, השמיעו את בקבוק תרבית Mtb באמבט מים (130 W; 3 x 5 s פולסים) פעם או פעמיים בשבוע.
2. תנאי תרבית לתאי THP-1
- הכינו מצע תאי THP-1 מלא (RPMI-C) על ידי תוספת RPMI 1640 בינוני עם 10% סרום בקר עוברי מומת חום, 2 mM L-גלוטמין ו-10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid).
- לדגור על תאים בבקבוק T-75 ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2.
- ספרו תאים באמצעות המוציטומטר או ציטומטריית זרימה אחת ליומיים ושמרו על תאי THP-1 בצפיפות שבין 0.1 ל-0.6 מיליון למ"ל.
3. פרוטוקול זיהום ליצירת מבנים מצטברים Mtb/מקרופאגים
- הכנת תאי THP-1 (לכל צלחת של 96 בארות)
- צנטריפוגה 7 x 106 תאי THP-1 ב 250 x גרם במשך 5 דקות. השהיה מחדש ב 7 מ"ל RPMI-C.
- הכנת Mtb-GFP
- צנטריפוגה 2.8 x 108 Mtb-GFP ב- 3,200 x גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת באמצעות המרה של OD600 1.0 = 3 x 108 חיידקים/מ"ל.
- יש לשטוף פעם אחת עם RPMI-C וצנטריפוגה כמו בשלב 3.2.1.
- השהה מחדש ב 7 מ"ל RPMI-C ומערבולת במשך 10 שניות.
- זיהום
הערה: ראה איור 1 עבור התבנית.
- הכינו צלחת בת 96 בארות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים סטריליים בשורות A ו-H ובעמודות 1 ו-12 לשפת מים כדי למנוע אידוי של מדיום התרבית.
- הוסף 200 μL RPMI-C לעמודה 2 (B2 עד G2) עבור פקד הרקע (ריק).
- כדי להדביק, הוסף תרחיף Mtb-GFP (שלב 3.2) לתרחיף תאי THP-1 (שלב 3.1) וערבב היטב על ידי פיפטציה. צפיפות התאים הסופית של THP-1 היא 5 x 105 למ"ל וריבוי הזיהום המתאים הוא 40.
- יוצקים את מתלה THP-1/Mtb-GFP למאגר של 25 מ"ל.
- הוסף 200 μL של תרחיף THP-1/Mtb-GFP לכל 96 הבארות הנותרות (B3 עד G11) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
הערה: אם אתם עובדים עם מספר לוחות של 96 בארות, השהו מחדש באופן קבוע את מתלה THP-1/Mtb הנותר במאגר כדי להבטיח תוספת תערובת אחידה לכל באר.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 7-10 ימים.
- שנה מדיה כל יומיים על ידי הסרה איטית של מדיה משומשת של 100 μL מהחלק העליון של כל באר והוספה עדינה של 100 μL RPMI-C שחומם מראש באמצעות צינור רב ערוצי. אין להשעות מחדש בארות ולהפריע לצברי Mtb/מקרופאגים בתחתית הבארות.
- לבחון חזותית את הבארות במיקרוסקופ פלואורסצנטי (4-10X אובייקטיבי) מדי יום, תוך שימת לב לגודל של אגרגטים Mtb/מקרופאגים. ביום 7-10, צברי Mtb/מקרופאגים צריכים להיות גדולים מספיק (ראו איור 2 לעיון) כדי להמשיך בבדיקת יעילות התרופה (סעיף 4).
- אם תרצה, צלם תמונות של 96 הבארות באמצעות מערכת הדמיה תאית אוטומטית המצוידת בשדה בהיר ובערכות מסנני GFP כדי לתעד היווצרות צבר Mtb/מקרופאגים.
הערה: אם למשתמשים אין גישה למערכת הדמיה אוטומטית, ניתן לצלם תמונות של בארות מייצגות באמצעות כל מיקרוסקופ מתאים עם יכולות GFP ושדה בהיר.
4. בדיקת עיכוב גדילה להערכת יעילות התרופה נגד Mtb הנגזר מצברי Mtb/מקרופאגים
- הכנת תרופות (תנאים משולשים לשתי תרופות)
הערה: ראה איור 1A עבור התבנית.
- בצלחת נפרדת של 96 בארות, הוסף 125 μL של מדיה 7H9-C ל- B2 עד G10.
- הכינו שתי תרופות בריכוז הסופי הגבוה ביותר הרצוי ב-1 מ"ל של 7H9-C כדי להסביר את הדילול בשלב 4.2.4.
- הוסף 250 μL של כל תרופה לבארות B11-C11-D11 ו- E11-F11-G11, בהתאמה לטיפולים משולשים.
- באמצעות צינור רב ערוצי, לדלל באופן סדרתי את תרופות הבדיקה פעמיים על ידי העברת 125 μL מ B11-G11 לתוך B10-G10. מערבבים על ידי פיפטינג 5 פעמים בכל שלב.
- המשך להעביר 125 μL מעמודה לעמודה (מימין לשמאל) על פני הצלחת, ועצור אחרי עמודה 4.
- לאחר ערבוב עמודה 4, יש להשליך 125 μL למיכל פסולת. עמודות 2 ו- 3 אינן אמורות להכיל תרופות כלשהן כדי לאפשר שימוש כרקע (ריק) ובקרות גדילה חיוביות.
הערה: לחלופין, עקבו אחר התבנית באיור 1B לבדיקת ספריות תרופות. כל צלחת של 96 בארות יכולה להכיל 58 תרופות בריכוז אחד. הכן צלחת תרופה זו באמצעות כפול הריכוז הסופי הרצוי מאז זה יהיה מדולל לשניים בשלב 4.2.4.
- טיפול תרופתי:
- אחזר את צלחת 96 בארות המכילה את המקרופאגים הנגועים ב- Mtb (אגרגטים Mtb/מקרופאגים).
- בזהירות decant כל הבארות הרלוונטיות (B2 עד G11) עם pipet רב ערוצי. בצע זאת באופן דו-שלבי: ראשית, הסר 150 μL מבלי להטות את הצלחת, ולאחר מכן הסר את המדיה הנותרת (~ 50 μL) על ידי הטיית הצלחת והכנסת קצה פיפטה לקצה התחתון של הבאר. מכיוון שצברי Mtb/מקרופאגים נצמדים לתחתית הבאר, אין לאבד חומר.
- הוסף בעדינות 100 μL של מדיה 7H9-C לכל הבארות הרלוונטיות (B2 עד G11) של הלוח המכיל את אגרגטי Mtb/מקרופאגים.
- באמצעות צינור רב ערוצי, להעביר 100 μL מן צלחת 96-באר המכילה תרופה (שלב 4.1) אל הבארות המתאימות של צלחת הזיהום.
- מניחים בשקית אטומה ודגרים במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
5. כימות יעילות התרופה באמצעות בדיקת Resazurin Microtiter
- הכינו תמיסת מלאי רסזורין בריכוז סופי של 0.8 מ"ג/מ"ל ב-H2O. סננו דרך קרום פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר לצורך עיקור.
- הכן פתרון עבודה resazurin על ידי ערבוב תמיסת מלאי resazurin, H2O ו- Tween-80 (תמיסה של 20% ב- H2O) ביחס של 2:1:1. הריכוזים הסופיים הם 0.4 מ"ג/מ"ל רזזורין ו-5% טווין-80.
- באמצעות קורא לוחות, הגדר תוכנית לקריאת פלואורסצנטיות בעירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר כל 30 דקות למשך 24 שעות ב-37°C. קורא צלחות חם מראש ל-37°C.
- הוסף 20 μL של תמיסת עבודה resazurin לכל הבארות הרלוונטיות (B2 עד G11) של הצלחת שטופלה בתרופות (שלב 4.11) באמצעות צינור רב ערוצי.
- הנח את הצלחת על קורא הלוחות והתחל את התוכנית המוגדרת בשלב 5.3.
הערה: כדי להקל על עיבוד של כמויות גדולות של לוחות המבחן, זה מספיק כדי לפתח את הבדיקה באינקובטור 37 ° C ולבצע קריאות פלואורסצנטיות יחיד כל 24 שעות. זה חל גם על משתמשים שאין להם גישה לקורא צלחות עם יכולות קינטיות ודגירה.
