כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. יום 1
הערה: בצע את כל השלבים המתוארים להלן בארון בטיחות ביולוגית סטרילי של זרימה למינרית המשמש לתרבית רקמות במעבדת BSL-2.
- הפשירו את דגימות הסרום בטמפרטורת החדר והעבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימת סרום לצינור סטרילי. יש להשבית את החימום למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56°C באמבט מים או בתרמומיקסר הניתן לכוונון טמפרטורה. בצע דילולים סדרתיים פי 10 של דגימת הסרום בטווח של 1:1 עד 1:1,000 באמצעות RPMI-10 קר (RPMI עם 10% נסיוב בקר עוברי).
- העבירו 10 μL של דגימת סרום בדילול סדרתי לכל באר של צלחת סטרילית בעלת 96 בארות V-תחתית. כלול שתי קבוצות של בארות בקרה, RPMI-10 עם RVPs בלבד וללא דגימת סרום, ו- RPMI-10 רק ללא RVPs וללא דגימת סרום. הגדר כל דגימת סרום ופקדי RPMI-10 בטריפליקטים.
- הסר את דנגי-1, 2, 3 ו 4 RVPs מהמקפיא -80 ° C והפשיר אותם באמבט מים 37 ° C. מעבירים מיד את הקרוואנים המופשרים לקרח. קבל כ- 170 μL RVPs עבור כל דגימת סרום (10 μL של RVPs x 3 בארות עבור כל דילול סרום (1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000) ו- 10 μL של RVPs x 3 בארות עבור כל אחת מבארות RPMI-10 עם בארות בקרה RVP בלבד).
- פיפטה 10 μL של RVPs לכל באר של צלחת V-תחתית 96 באר המכילה את דגימת הסרום ולבארות הבקרה RPMI-10 עם RVPs (ללא סרום). אין להוסיף RVPs לבארות RPMI-10 בלבד (ללא דגימת סרום וללא RVP). מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה 5-10 פעמים. הוסף 10 μL סל"ד קר-10 במקום RVP לכל בארות בקרה של סל"ד קר בלבד (ללא דגימת סרום וללא RVP).
- מעבירים את הצלחת התחתונה V 96 באר לאינקובטור ודגרים על הצלחת למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2. בזמן שהפלטה התחתונה V בעלת 96 בארות דוגרת, נקו את פני ארון הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול והפעילו את אור ה-UV למשך 15 דקות.
- הסר בקבוק T75 מלא של תאי K562 מהאינקובטור, ערבב היטב את התאים באמצעות פיפט סטרילי של 5 מ"ל, והעבר 5 מ"ל תאים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
הערה: תאי K562 נשמרים בסל"ד-10 ותת-תרבית בגודל 1 x 106/מ"ל.
- לספור את מספר התאים על ידי הסרת 10 μL תאים מן הצינור החרוטי סטרילי 15 מ"ל ולערבב עם 10 μL טריפאן כחול. ספור את התאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את החרוט 15 מ"ל עם תאים ב~ 1,200 x גרם במשך 10 דקות, לרוקן את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים בסל"ד חם -10 בריכוז של 80,000 תאים / 30 μL של מדיה (2.66 x 106 תאים / mL).
- הסר את צלחת 96 בארות V-bottom מהאינקובטור (שלב 1.6), העבר 30 μL של תאי K562 לכל באר של צלחת V תחתונה 96 באר, וערבב היטב על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 5-10 פעמים. מעבירים את הצלחת התחתונה V 96 בארות לאינקובטור ודגרו על הצלחת למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2.
- לאחר הדגירה במשך שעה אחת, הסר את צלחת V התחתונה 96 באר מן האינקובטור והצנטריפוגה ב ~ 1,200 x גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, רוקנו את המדיה מהבארות על ידי הפיכת הצלחת למיכל המכיל 10% אקונומיקה.
- שטפו את התאים בכל באר על ידי השעייתם מחדש ב-125 מיקרוליטר של סל"ד חם-10, ערבבו היטב עם פיפטה וצנטריפוגו את הצלחת ב~1,200 x גרם למשך 5 דקות. דקרו את המדיה על ידי הפיכת הצלחת למיכל המכיל 10% אקונומיקה. חזור על שלב השטיפה פעמיים.
- לאחר הכביסה, להוסיף 100 μL של סל"ד חם -10 לכל באר, לערבב למעלה ולמטה עם pipet, ולדגור את הצלחת במשך 48 שעות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2.
2. יום 3
- הסר את לוח V התחתון 96 באר המכיל 100 μL של תאים ומדיה / באר מן האינקובטור ולהעביר אותו לארון בטיחות ביולוגית. באמצעות פיפטה רב ערוצית, מערבבים את התוכן של כל באר ומעבירים את התאים והמדיה לצלחת U-bottom 96 באר או לצינורות פוליפרופילן 5 מ"ל מסומנים מראש.
- יש לשטוף כל באר בלוח התחתון V בעל 96 בארות עם 100 μL של 1% Paraformaldehyde (PFA) ב-1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) ולהעביר לבארות המתאימות בלוח U-bottom של 96 בארות או צינורות פוליפרופילן 5 מ"ל מסומנים משלב 2.1 כדי להניב ריכוז סופי של 0.5% PFA/באר או צינור. מערבבים היטב באמצעות פיפטה רב ערוצית, מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום, ונותנים לו לשבת באינקובטור במשך 30 דקות כדי לתקן את התאים.
- הכן את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים לדוגמה) על-ידי הפעלת תאי K562 לא מוכתמים כדי לכייל את הפיזור הצידי והקדמי יחד עם הגדרות הפלואורסצנטיות. תעלת הפלואורסצנטיות היחידה הנדרשת היא FL1, שכן GFP היא הפלואורסצנטיות היחידה הנפלטת מהתאים. לרכוש ~ 30,000-50,000 תאים מכל דגימה.
הערה: כל ציטומטר זרימה המסוגל לקרוא פלואורסצנטיות יחידה יכול לשמש להשגת הנתונים, מכיוון שתאים הנגועים ב- RVPs יפלטו רק פלואורסצנטיות ירוקה בשל נוכחות GFP, ואין צורך בתעלות פלואורסצנטיות אחרות.
3. ניתוח נתונים
- נתח נתונים המתקבלים בציטומטר הזרימה באמצעות כל תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (ראה טבלת חומרים).
- הגדר את השער הראשון בהתבסס על FSC-A (פיזור קדימה - שטח) לעומת FSC-H (פיזור קדימה - גובה) כך שיכלול תאים בודדים ולא יכלול כפילים פלואורסצנטיים אוטומטיים בניתוח. לאחר מכן, שער תאים מגודרים יחיד מבוסס על SSC-A (פיזור צד - שטח) לעומת FSC-A כדי לא לכלול פסולת אוטופלואורסצנטית.
- נתח תאים מגודרים SSC-A לעומת FSC-A עבור ביטוי GFP בהתבסס על SSC-A לעומת GFP-A. קבע את אחוז תאי GFP+ עבור כל דילול של דגימות הסרום ובקר על ידי הגדרת שער סביב תאי GFP+ .
- קבע את האחוז הממוצע של תאי GFP+ עבור כל דילול דגימת סרום ובקר בארות על ידי חלוקת האחוז הכולל של תאי GFP+ בבארות המשולשות ב- 3.
- חישוב שיפור קיפול של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של תאי GFP+ בדגימות הסרום עבור כל דילול באחוז הממוצע של תאי GFP+ בסל"ד 10 עם בארות בקרה RVPs (ללא דגימת סרום).
- שיפור קיפול גרפים (ציר y) לעומת דילול (ציר x), וביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.
