1. סינון ננו-מעכבי TLR4 פוטנציאליים באמצעות תאי הכתב
NOTE: מכיוון שאיתות TLR4 משתמש בשני מסלולים תלויי TRIF קרקעיים תלויי MyD88, הוא נבחר כיעד העיקרי להקיף מגוון רחב של מסלולי איתות TLR. תאי כתב THP-1-XBlue משמשים בעיקר לבחינת הפעלת NF-κB/AP-1 ואילו תאי THP-1-Dual מיועדים להפעלת IRF מהעברת אותות תלויי TRIF.
- זהה את מינון LPS האופטימלי על ידי יצירת עקומת מנה-תגובה לפני ההקרנה.
- לדלל את פתרון LPS עובד לריכוז סופי של 0.01 - 100 ng / mL בתווך R10 (לבצע דילול בקנה מידה log10). פרוס את עיצוב הצלחת ובצע דילול בצלחת תרבית בעלת תחתית עגולה של 96 בארות. ודא כי כל באר יש מינימום של 110 μL של פתרון לאחר דילול.
- הסר בעדינות את מדיום התרבית מצלחת זרעי התא באמצעות שואב ואקום.
- מעבירים את ה-LPS המכיל מדיום R10 שהוכן בצלחת הדילול (1.1.1) לצלחת התרבית בהתאם לפריסת הדגימות. לדגור על הצלחת ב 37 ° C (באינקובטור תרבית תאים) במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, העבירו בזהירות את הסופרנאטנטים (80 מיקרוליטר/באר) לצלחת חדשה בעלת תחתית עגולה בעלת 96 בארות. בצע את בדיקת הלומינסנציה של קולורימטרי ו / או לוציפראז על תמיסות אלה באופן מיידי או אחסן אותן ב -4 ° C (מספר שעות) או -20 ° C (ימים) לפני פיתוח הבדיקה.
הערה: העיצוב של פריסת הצלחת צריך להיות פשוט וברור לניסוי וניתוח נתונים. עבור כל מצב, 2-4 משכפלים יש לשקול. כלול תמיד קבוצת ביקורת שלילית (LPS null). מומלץ להשתמש בתאי THP-1-XBlue להפעלת NF-κB/AP-1 מכיוון שלתאים הכפולים יש רקע גבוה יחסית של הפעלת NF-κB/AP-1 לאחר התמיינות למקרופאגים. עם זאת, ניתן להשתמש בתאים הכפולים לדיווח הן על NF-κB/AP-1 והן על הפעלת IRF.
- פתח את הבדיקה colorimetric עבור הפעלת NF-κB/AP-1 ואת בדיקת luminescence luciferase עבור הפעלת IRF.
- כדי להעריך את הפעלת NF-κB/AP-1, העבירו 20 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל דגימה ללוח תרבית חדש בעל תחתית שטוחה של 96 בארות, והוסיפו 180 מיקרוליטר של תמיסת מצע SEAP שחוממה מראש לכל באר. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 1 - 2 שעות כדי לאפשר את התפתחות הצבע (ורוד עד כחול כהה). לאסוף את הספיגה ב 655 ננומטר על קורא צלחת.
זהירות: ניתן לשנות את זמן הדגירה בהתאם להתפתחות הצבע (30 דקות עד דגירה לילה). מומלץ להמתין עד שהצפיפות האופטית (O.D.) של הצבע הכהה ביותר תגיע מעל 1 תוך הימנעות מרוויה של התפתחות הצבע (O.D >3).
- לצורך ניתוח הפעלת IRF, העבר 10 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת לבנה שטוחה שקופה 96 בארות. מוסיפים את תמיסת לוציפראז (50 μL) ומיד אוספים את הלומינסנציה היטב על ידי באר.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש בקורא לוחות הארה עם פונקציית הזרקה אוטומטית כדי להבטיח עקביות בקריאת ההארה מבאר לבאר ומצלחת לצלחת. אם תמיסות המצע מוזרקות ידנית, יש להקפיד על זמן דגירה עקבי והגדרת קריאה לכל באר.
- בצע את בדיקת הסקר על היברידים פפטידים-תל"ג שונים עם גירוי LPS של 10 ננוגרם/מ"ל (מבוסס על 1.1). בצע את אותו הליך ב- 1.2 לפיתוח בדיקת הכתב.
- רכז את הכלאיים הפפטידים-תל"ג ל-200 ננומטר בתווך R10 בשיטת הצנטריפוגה. צנטריפוגה 20 נפחים של הפתרון ההיברידי (10 ננומטר) ב 18,000 x גרם במשך 30 דקות, ובזהירות להשליך את supernatants. אספו את ההיברידים (בתחתית הצינור) לתוך צינור, שטפו אותם עם PBS פעמיים, והשהו מחדש את ההיברידים בנפח אחד של מדיום R10.
- ערבבו נפחים שווים של ההיברידים המרוכזים וה-LPS (20 ננוגרם/מ"ל) המכיל תווך R10 כדי שהריכוז הסופי של ההיברידים וה-LPS יהיה 100 ננומטר ו-10 ננומטר/מ"ל, בהתאמה.
- הסר את מדיום התרבית מהצלחת המתורבת והוסף 100 מיקרוליטר של התמיסה המעורבת לכל באר (3 עותקים משוכפלים לכל תנאי); כלול בקרה שלילית (בינונית בלבד) ובקרת LPS (10 ננוגרם/מ"ל LPS ללא היברידים).
- לאחר 24 שעות דגירה ב 37 ° C, להעביר את התווך של כל באר לתוך צינור צנטריפוגה צינורות ב 18,000 x גרם, 4 ° C במשך 30 דקות. לאסוף את supernatants (50-80 μL / צינור) לתוך צלחת עגולה 96 באר, ולבצע את בדיקת כתב כמתואר 3.2.
זהירות: בעת השלכת הסופרנאטנטים לאחר צנטריפוגה, אין להרגיז את בני הכלאיים בתחתית הצינור.
הערה: הצנטריפוגה בשלב 1.3.4 חשובה מאוד להסרת הכלאיים הננו-חלקיקיים הלא מופנמים ממדיום התרבית, ויכולה למנוע את ההפרעה של בני הכלאיים עם קריאות הקולרימטריות/לומינסנציות. הסיבה לכך היא שחלקיקי הזהב יכולים לקלוט אורכי גל רחבים של אור בהתאם לגודלם ולהצטברות שלהם.
2. אימות ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים
הערה: כדי לאשר את ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים מהמיון, נעשה שימוש בשתי גישות. האחת היא לבחון את תגובות המינון של הממריצים (LPS) בריכוז היברידי קבוע (או להיפך); השנייה היא להסתכל ישירות על עיכוב האותות NF-κB/AP-1 ו-IRF3 באמצעות אימונובלוטינג.
- בגישה הראשונה, בצע את בדיקת הכתב עם 100 ננומטר של הכלאות עופרת ושני ריכוזי LPS ב 1 ng/mL ו 10 ng / mL בהתאם לאותם הליכים המתוארים ב 1.3. כלול היברידי לא פעיל (בהתבסס על תוצאות הסינון) כפקד היברידי לצורך השוואה.
- עבור גישת immunoblotting, אנא בצע את הליכי הניסוי הסטנדרטיים.
- תרבית תאי THP-1 בתווך R10, זרעה את התאים לתוך צלחת תרבית של 12 בארות (2 x 106 תאים / באר), והמיין אותם למקרופאגים על ידי טיפול בתאים עם PMA 50 ng/mL במשך 24 שעות ולאחר מכן מנוחה במשך יומיים.
- לאחר התמיינות תאים, לעורר תאים עם LPS 10 ng/mL עם/בלי היברידים (100 ננומטר) לאורך זמן (עד 4 שעות). בנקודות זמן שונות (0, 5, 15, 30, 60, 120 ו -240 דקות), להכין את התא lysates עבור immunoblotting. כלול היברידי לא פעיל כפקד.
- בדוק את האותות של IκBα, phosphorylated p65, ו IRF3 phosphorylated כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של היברידים עופרת על ההפעלה של NF-κB ו IRF3. בדוק את אותות β-actin ו- IRF3 הכולל כבקרות פנימיות.
הערה: העברת האות מתרחשת לעתים קרובות הרבה יותר מהר (תוך מספר שעות) מאשר הביטוי של אנזימי הכתב SEAP ולוציפראז (24 שעות). מומלץ מאוד לבצע גם בדיקת כדאיות של ההיברידים שנבדקו ב-24 שעות כשיטת תיקוף נוספת.
3. הערכת הספציפיות של TLR
הערה: כדי לחקור את הספציפיות של TLR של הכלאה של פפטיד עופרת-תל"ג, נבדקים מסלולי איתות TLR אחרים, כולל TLR2, TLR3 ו- TLR5. TLR7, 8 ו-9 אינם נכללים מכיוון שהמקרופאגים שמקורם ב-THP-1 אינם מגיבים היטב לגירוי של TLRs אלה בשל היעדר ביטוי TLR7, 8 ו-9 במקרופאגים.
- בדוק ריכוזים שונים (1 ng/mL עד 25 μg/mL) של ליגנדות ספציפיות ל-TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I:C) ו-TLR5 (flagellin) על שני תאי הדיווח שמקורם במקרופאגים כדי להשיג את הריכוז האופטימלי לאחר אותו הליך ב-1.1 וב-1.2.
- טפל בתאים עם התערובות של הכלאה עופרת (100 ננומטר) וכל ליגנד TLR בריכוז המתקבל מ 3.1 כדי להעריך את הספציפיות המעכבת של היברידי עופרת על פי ההליך הניסיוני המתואר ב 1.3. כלול את ההיברידי הלא פעיל כפקד להשוואה.
