כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד איברים
הערה: הנגיף אינו יציב בטמפרטורת החדר (RT) ולכן יש לתכנן בקפידה את מספר בעלי החיים שנקטפו בו זמנית כדי לשמר טיטרים נגיפיים.
- להדביק עכברים באמצעות המינון והמסלול שנבחרו, בהתבסס על הפנוטיפ הנדרש. עבור פרוטוקול זה, להדביק 8-10 שבועות זכר ונקבה סוג I אינטרפרון חסר קולטן (Ifnar1-/-) C57BL/6 עכברים.
- מרדימים עכברים Ifnar1-/- עם קוקטייל של קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). בדוק את רפלקס הדוושה על ידי צביטת בוהן חזקה כדי לאשר את ההרדמה. ניהול 1 x 105 יחידות יוצרות מיקוד (FFU) של ZIKV ב 50 μL תת עורית (SC) דרך כרית כף הרגל.
- הכינו את כל החומרים הדרושים לקציר יום לפני 2 מספריים, מלקחיים ו-20 מ"ל אתנול 70% (EtOH) בחרוט של 50 מ"ל לחיטוי כלים.
- הכינו מזרקים ומחטים: מזרק 20 מ"ל לזילוח, 23 גרם מחטים (כ 1 לכל כלוב), ומזרק 1 מ"ל עם 25 מחטים G (1 לכל 3-5 עכברים). לפני שקילת הצינורות, הוסף חרוזי פלדה (במכסה המנוע) לצינורות מכסה בורג O-ring בנפח 1.5 מ"ל (אחד לכל איבר). הצינורות צריכים להיות מתאימים להומוגניזציה.
- הכינו ביום הקציר את החומרים הדרושים לזילוח ולהקפאת האיברים.
- מלאו דלי קרח בקרח יבש ו-70% EtOH כדי ליצור אמבטיית קרח. הכינו מלח חוצץ פוספט סטרילי (PBS) בהנחה שיש צורך ב-25-30 מ"ל לעכבר של PBS עבור כל זילוח 5-10 מ"ל עבור חוט השדרה). קבל הרדמה, קוקטייל של קטמין וקסילזין, ולהניח 300 μL לכל עכבר. הניחו את כל החומרים וכל צינור נוסף הדרוש לזרימה, ציטומטריה וכו', במיכל משני להובלה למתקן בעלי החיים.
- בצע את כל ההליכים הדרושים לכניסה, כולל חבישה וטבילה של ציוד הגנה אישי במהלך הכניסה והיציאה למתקן בעלי החיים.
זהירות: כל ההליכים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית מוסמך בתוך מתקן מעבדה לבטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2).
- לנהל הרדמה, 200-500 μL, intraperitoneally בהתאם לגודל ומשקל של החיה. אם אתם עובדים לבד, תנו הרדמה לחיה אחת בכל פעם כדי להימנע מהריגת החיות לפני קצירת האיברים.
- אשר את מינון ההרדמה על ידי צביטת הבוהן במלקחיים כדי להעריך את רפלקס הדוושה. אין להמשיך אלא אם כן אינך מגיב לחלוטין. השתמש בפינים כדי לאבטח את העכבר ללוח שעווה. בשלב זה, לטבול את העכבר באתנול 70% כדי למנוע זיהום שיער בהליך קצירת האיברים.
- דימום סופני על ידי ניקוב לב.
- באמצעות מספריים ומלקחיים, לפתוח את החיה דרך חלל החזה כדי לחשוף את הלב. לאסוף דם באמצעות ניקוב לב (~ 800 μL), זה יכול לשמש עבור בדיקות מרובות כולל כימיה קלינית, המטולוגיה, ציטומטריה זרימה כדי לזהות תגובות ספציפיות אנטיגן, ו PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) לניתוח של מספר עותק נגיפי.
- לניתוח RNA נגיפי על ידי qRT-PCR, יש לאסוף דם בצינור EDTA אם חילוץ מדם שלם או בצינור מיקרוצנטריפוגה אם חילוץ מסרום. (לסרום, סובבו את הצינור במהירות מרבית בצנטריפוגה, בטמפ' החדר, למשך 20 דקות, והוציאו את הסרום לצינור נפרד). הוסף פוליאקרילאמיד ליניארי כנשא לדגימת הסרום לאחר סיום. לאחר מכן ניתן לנתח או לאחסן RNA ב -80 °C כדי להמשיך לעבד במועד מאוחר יותר.
- ממלאים את מזרק 20 מ"ל עם PBS, בטמפרטורת החדר (או 37 מעלות צלזיוס), ומחוררים עכברים על ידי החדרת מחט הפרפר לחדר השמאלי. נקבו את האטריום הימני כדי לאפשר לדם ול-PBS לצאת. לאט לתת את PBS תוך בדיקת צבע הכבד כדי לאשר כי החיה מחוררת לחלוטין. הכבד צריך להשתנות מצבע אדום עמוק לסלמון ורוד.
- אם מכינים את האיברים להיסטולוגיה, להשאיר את מחט הפרפר במקום ולאחר מכן לנקב עם 20 מ"ל של 4% paraformaldehyde קר כקרח. אם כן, נוח לחבר את המזרק לסטופקוק תלת כיווני עם שני מזרקים מחוברים אליו, להפעיל ולכבות את השסתום כשעוברים לסירוגין בין PBS ל- PFA.
- קצרו איברים לצינורות מסומנים ונשקלים. עבור איברים היקפיים, בצע סדר מוגדר לקציר: כבד, טחול, כליות וריאות.
- קח רק אונה אחת מהכבד; זה לא משנה איזה, אבל עבור כל הניסויים תמיד לנסות לקחת את אותה אונה עם אותו גודל חתיכה. באופן דומה, עבור כליות וריאות, לקחת את אותה כליה וריאות. אם יש להשלים גם את ציטומטריית הזרימה, ניתן לחתוך כל איבר לשניים. אחסנו את החצי שישמש לציטומטריה במדיום של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) בטמפרטורת החדר עד להשלמת הקציר.
- מיד לאחר הקציר, לשים כל איבר בצינור מסומן ומניחים אותו באמבט קרח יבש. טיטר הנגיף פוחת עם הזמן בטמפרטורת החדר, ולכן משך הזמן שלוקח לקצור איברים הוא חשוב ביותר. חייבת להיות עקביות בין עכברים, ולכן לאחר בטיחות, העדיפות הבאה היא מהירות.
הערה: אם קוצרים איברים עבור טיטרים נגיפיים, זה מאוד מועיל שאדם שני יקצור את המוח בשלב זה, כדי לשמר טיטרים ויראליים.
- הסר את האיברים הנותרים מחלל גוף העכבר כדי לקבל גישה לעמוד השדרה ולגולגולת.
- הסר את העכבר מהלוח והסר את הפרווה, ולאחר מכן הסרת הידיים והרגליים.
הסר את ראש העכבר עם עריפת ראש, קהה או מספריים כירורגיים כדי לקצור את המוח על ידי חיתוך הגולגולת עם מספריים משוננים LaGrange דרך מגנום הפורמן. לאחר מכן, לקלף את הגולגולת עם מלקחיים ולגרוף את המוח עם מרית.
- בעזרת מספריים חזקים וקהים, הסירו את הצלעות ועצמות אחרות המקיפות את עמוד השדרה. לאחר מכן, לחתוך את עצם האגן, לחשוף את פתח החוליות ברמה המותנית. הקצה הקטן של חוט השדרה אמור להיות גלוי בשלב זה.
- השתמש מזרק 10 מ"ל מלא PBS ומחט 18 G כדי לגרש את חוט השדרה על ידי "שטיפה" של החוט מן המותני לעמוד השדרה הצווארי מעל צלחת פטרי.
- בזהירות, הניחו את הקצה המשופע של המחט בתוך פתח החוליה, והימנעו מלחץ מוגזם כדי למנוע מהמחט להסיג גבול בגוף החוליה. החזק חזק כדי להפעיל לחץ על גוף החוליה והמחט ולחץ על בוכנת המזרק כדי להוציא את הכבל. העבירו מיד את חוט השדרה לצינור המסומן והניחו אותו באמבט הקרח היבש.
- חזור על התהליך עם כל בעלי החיים עד לסיום הקציר. מניחים את כלי הקציר באתנול 70% בין בעלי חיים. התמקדו בעקביות ובמהירות. משך הזמן בין כל קצירת איברים צריך להישאר עקבי כדי לא להטות את תוצאות הטיטר הנגיפי.
- בסיום, יש לחטא את ארון הבטיחות הביולוגית ואת כל החומר לפני הוצאתו מהמתקן לבעלי חיים.
- הסר כל צינור מאמבט הקרח ושקול את הצינורות כדי לקבוע את משקל האיבר. כדי לקבוע את משקל האיברים, הפחיתו את משקל הצינור הריק ממשקל הצינור המכיל את האיבר.
הערה: בשלב זה, איברים יכולים להיות מוקפאים ב -80 ° C כדי להמשיך לעבד במועד מאוחר יותר או איברים יכולים להיות הומוגניים מיד לפני הקפאת aliquots בודדים. דגימות הפשרה בהקפאה מספר פעמים מפחיתות את הטיטר הנגיפי. לכן, חשוב לבצע את אותו הליך עבור כל הניסויים בתוך פרויקט אחד.
2. הומוגניזציה של איברים
- הכינו 3 צינורות הצמדה מסומנים בנפח 1.5 מ"ל כדי שכל איבר יהיה הומוגני.
- אם הדגימות אינן הומוגניות מיד לאחר הקציר, הסר צינורות מ -80 ° C. הדגימות אינן צריכות להיות מופשרות כדי הומוגניות.
- שים את הדגימות על קרח כדי לשמור אותם קרים כדי למזער אובדן titer נגיפי. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של DMEM קר המכיל 5% FBS לכל צינור המכיל איבר.
- מיד להכות צינורות במקציף חרוזים על פי הוראות היצרן. הומוגניזציה של כל האיברים עם חרוזי פלדה במכשיר הומוגנייזר חרוזים. בדוק כדי לוודא שכל איבר היה הומוגני לחלוטין.
- סובבו פסולת איברים במיקרופוגה במהירות של 12,000 x גרם במשך 5 דקות במיקרופוגה שצוננה ל-8°C. לאחר מכן החזירו את הצינורות לדלי הקרח. בארון הבטיחות הביולוגית, aliquot דגימות לתוך צינורות עבור בדיקות הכרחיות. לאחר מכן החזירו את הצינורות לדלי הקרח.
- לבדיקת יצירת מיקוד, aliquot 500 μL לתוך צינור מסומן. לאחר מכן הניחו את הצינורות במדף על דלי קרח. Aliquot 50 μL לתוך צינור עבור RNA עבור RT-PCR כמותי פלואורוגני (qRT-PCR) כדי למדוד את מספר העתק הגנום הנגיפי.
- בודדו את סך כל הרנ"א מאיברי בעלי החיים הנגועים באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית. קביעת RNA נגיפי flavivirus באמצעות ערכות פריימר-בדיקה ספציפיות עבור ZIKV, אשר מזהה רצפים ייחודיים בכל גנום flavivirus. קבע את מספר העותק הנגיפי באמצעות פלסמיד בקרת העתקה המכיל RNA חד-גדילי חיובי מוגדר שנוצר במבחנה באמצעות פולימראז T7 המכיל את רצפי המטרה ZIKV.
- Aliquot את הדגימה הנותרת, שהיא כ 300 μL, לתוך הצינור השלישי ולאחסן אותו ב -80 ° C במידת הצורך.
הערה: אם הדגימות לא הוקפאו בעבר, יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C. אם הדגימות הוקפאו בעבר, המשיכו לבדיקת יצירת המיקוד ו/או בידוד RNA לפני עצירה.
3. וירוס זיקה פוקוס יצירת בדיקה
הערה: חשוב לכלול בקרה ללא וירוסים ובקרה חיובית. הבקרה החיובית היא סדרת דילול של מלאי וירוסים עם ריכוז ידוע. לא כל הפקדים צריכים להיות על אותה צלחת, אך ככל שהבדיקה הופכת גדולה מ-5 צלחות, יש להוסיף פקדים נוספים ולפזר אותם בין הצלחות. היזהר לא לגרד את monolayer עם קצות pipet או על ידי כביסה נמרצת. איברים מרובים יכולים להיות titered באותו יום או בימים שונים. עם זאת, איבר בודד לא צריך להיות titered במשך מספר ימים כי תנאי בדיקה שונים יכולים להשפיע על titer ויראלי. מומלץ מאוד להפעיל איבר בודד ביום אחד.
- לפני יום הבדיקה, הכינו את התאים והריאגנטים הדרושים לניסוי יצירת המיקוד.
- הכן מדיה צמיחה המכילה 500 מ"ל של DMEM עם 5 מ"ל של HEPES ו 25 מ"ל של FBS. יש תאי Vero-World Health Organization (WHO) הגדלים במצע גידול ב 37 ° C, 5% CO2 לפני תחילת הבדיקה. תאי Vero לא צריכים להיות מעבר גבוה או אי פעם גדל מעל 100% מפגש לפני תחילת הבדיקה.
- הכינו 500 מ"ל של תמיסת מתילצלולוז 2% על ידי אוטוקלאבינג בקבוק מדיה מזכוכית 1 ליטר עם 10 גרם מתילצלולוז, ומוט ערבוב גדול, ובקבוק מדיה נפרד מזכוכית 1 ליטר עם 500 מ"ל של H2O. אם המים האוטומטיים התקררו, חממו מחדש במיקרוגל עד שהבקבוק חם למגע, אך לא רותח.
- מזגו בעדינות מים חמים/חמים לתוך בקבוק מתילצלולוז בעודכם בתרבית הרקמה. מכסים חלקית את הבקבוק ומערבבים על הפלטה החמה עד שמתילצלולוז נמצא בתמיסה (1-4 שעות). Aliquot תמיסת 2% methylcellulose לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. 2% מתילצלולוז ניתן לאחסן ב 4 ° C עד הצורך.
- הכינו תמיסת פרפורמאלדהיד 5% ב-PBS לקיבוע הצלחות ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C עד לצורך. הכינו חיץ שטיפת בדיקה 1x ליצירת פוקוס על ידי הוספת 0.05% Triton X-100 ל-PBS ואחסנו ב-RT. הכינו חיץ צביעה FFA 1x על ידי הוספת 1 מ"ג/מ"ל סאפונין ל-PBS ואחסנו ב-4°C עד לצורך. ניתן להכין אותם שבוע עד שבועיים מראש.
- חשב את מספר 96 לוחות באר שטוחים למטה הדרושים לבדיקה כך שכל איבר מצופה משולש. כלול מספיק בארות נוספות לבקרות חיוביות ושליליות.
- לגדל מספיק תאי Vero במדיה צמיחה כדי להשלים את הבדיקה שתוכננה. טריפסיניזציה של תאי Vero וספירת אותם מחדש ב 1.5 x 105 תאים לכל מ"ל במדיה גדילה. תאי Vero צלחת ב 96 לוחות שטוחים היטב ב 3.0 x 10 4 תאי Vero-WHO/באר במצע צמיחה על ידי הוספת 200 μL לכל באר.
- דגרו על צלחות בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 למשך הלילה, וודאו שהלוחות ישרים באינקובטור כך שהתאים יפוזרו באופן שווה בתוך הבאר.
הערה: כל מעבדה מגדלת תאי Vero מעט שונה; היעד הוא חד-שכבה מתמזגת של 90-95% בכל באר ביום הבדיקה לנגיף זיקה.
- לדלל דגימות וירוס זיקה ביום הבדיקה. אם דגימות האיברים היו הומוגניות בעבר, הוציאו דגימות מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C ואפשרו להן להפשיר לפני הנחת הדגימות על קרח לצורך הבדיקה.
- על הקרח, הכינו צלחת עגולה תחתונה 96 על ידי הוספת 180 מיקרוליטר של מצע צמיחה קר לשורות B עד H ומשאירים את שורה A ריקה. הוסף 150 μL של כל דגימת איבר הומוגנית לשורה A של הלוח התחתון העגול.
- הכינו דילולים סדרתיים פי 10 של כל דגימה, באמצעות פיפטה רב ערוצית. לדלל דגימות בתחתית עגולה 96 צלחת באר על ידי הוספת 20 μL של דגימה לתוך 180 μL של מצע גידול, שינוי קצות פיפטה בין כל דילול.
- הכינו את צלחת יצירת המיקוד על ידי הסרת המדיה מצלחת 96 הבאר בעלת התחתית השטוחה המכסה את תאי ורו. עשו זאת מיד לפני הוספת דגימות הנגיף כדי למנוע מהשכבה החד-שכבתית להתייבש.
- הוסף 100 μL של דילול הנגיף לכל באר בצלחת ורו. הוסף דוגמה באמצעות אותה קבוצה של עצות על ידי מעבר מהריכוז הנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר. לוחות סלע מצד לצד 2-4 פעמים נזהרים לא להסתחרר.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 1-2 שעות. יש לוודא שהצלחות מפולסות בתוך האינקובטור. במהלך הדגירה יש להתחמם 2% מתילצלולוז ל-RT.
- לדלל 2% תמיסת מתילצלולוז במצע גידול. הדילול צריך להיות ביחס של כ-2:1 של 2% מתילצלולוז למצע הגידול. שמור אותו בטמפ' החדר עד שהגיע הזמן להשתמש בו. מוסיפים 1-2 טיפות/באר (מגדירים את הפיטה ל-125 מיקרוליטר) של מתילצלולוז: מצע גדילה לכל באר של צלחת 96 בארות.
- לדגור 32-40 שעות ב 37 ° C, 5% CO2. מכיוון שתאי ורו של כל אחד גדלים מעט אחרת, וגורמים הכוללים מפגש תאים וזן של נגיף הזיקה יכולים לשנות את זמן הדגירה.
- תקן את תאי Vero באמצעות תמיסת פרפורמלדהיד 5% שהוכנה.
- הוסף 50 μL של 5% paraformaldehyde לכל באר מעל החלק העליון של שכבת מתילצלולוז בארון הבטיחות הביולוגית. דגירה במשך 60 דקות ב- RT. התיקון יכול לעבור לילה ב 4 ° C אבל לכסות את הצלחת עם parafilm כדי להפחית אידוי.
- יש להשליך את שכבת העל והמדיה מהתאים למיכל סילוק בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. יש לשטוף בעדינות עם PBS, 150 μL/היטב. הסר PBS מהלוחות והסר את הצלחת מה- BSL-2.
- חזור על שטיפת PBS 2x הוספת 150 μL / טוב. לאחר מכן הסר את PBS. הוסף 150 μL / באר 1x FFA לשטוף חיץ ולתת לשבת במשך 5-10 דקות ב RT כדי לחדור את התאים קבועים.
- זיהוי זיהום באמצעות נוגדן זיקה ראשוני. הכינו את הנוגדן הראשוני 4G2 (D1-4G2-4-15) בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל במאגר צביעת FFA. הכינו מספיק נוגדנים לכל הבדיקה.
הערה: התרחקו מחיתולי מעבדה או מחומר סופג אחר בעל סיבים גבוהים, שכן הסיבים ישפיעו לרעה על הדמיה של המוקדים.
- הסירו את חיץ השטיפה FFA מהצלחות. הוסף 50 μL/well של הנוגדן הראשוני במאגר הצביעה FFA. אטמו את הצלחות עם פרפילם ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה. הבדיקה יכולה להיעשות עם דגירה במשך 2 שעות ב RT.
- דמיינו את הזיהום עם תוספת של נוגדן מצומד משני של HRP. הכינו את הנוגדן המשני נגד עכבר המסומן על ידי HRP בריכוז של 1:5,000 במאגר הצביעה FFA. הכינו מספיק נוגדנים לכל הבדיקה.
- שטפו את התאים 3x עם חיץ כביסה FFA, הסירו את חיץ הכביסה על ידי הכנסתו לכיור בכל פעם. לצבוע את התאים עם נוגדן משני בחיץ צביעת FFA ב 50 μL / באר. לדגור 1-2 שעות ב RT.
- שטפו את התאים 3x עם חיץ כביסה FFA, הסירו את חיץ הכביסה על ידי הכנסתו לכיור בכל פעם. הוסף 50 μL/well של המצע Trueblue.
- התבוננו היטב בצלחות, המתינו 2-15 דקות עד שהנקודות מוגדרות לחלוטין ורקע מינימלי. לאחר שהכתמים גלויים, שטפו בעדינות במים, באמצעות יד כדי להגן על השכבה החד-שכבתית מפני כוח המים הזורמים. יש לייבש בהקשה על מגבות נייר (לא חיתולים) והתמונה בהקדם האפשרי.
- ניתן לספור כתמים באופן ידני או באמצעות מונה ספוט אוטומטי. אם סופרים אותו ידנית, ניתן להשתמש בטווח ניתוח כדי לסייע בתצוגה חזותית.
- עבור כל דגימה, בחר דילול עם מוקדים קלים להבחנה (למשל, 20 עד 200 לכל באר) וחשב טיטר ביחידות יוצרות מיקוד למ"ל (FFU/ml), תוך שימוש בממוצע של בארות כפולות: FFU/mL = (מוקדים ממוצעים/באר) × (גורם דילול) ÷ (mL inoculum).
