כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. שאיבת דם ובידוד טסיות
- יש לשאוב דם אנושי מתורמים בוגרים בריאים בהסכמה באמצעות ניקור ביום הניסוי ל-3.8% טריסודיום ציטראט. צינורית אחת של 4.5 מ"ל דם מספיקה כדי להניב מספיק פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) עבור 20-25 מצבים בתורמים שספירת הטסיות שלהם קרובה ל 250 x 103 לכל μL.
הערה: הימנעו מלקיחת דם באמצעות מחטים צרות (קטנות מ-21 גרם).
- הכן PRP באמצעות צנטריפוגה ב 22 ° C ו 140 x גרם במשך 12 דקות עם בלם ארוך. התוצאה תהיה שתי שכבות נפרדות, עם תאי דם אדומים בתחתית ו- PRP בהיר בחלק העליון.
- בודדו את השכבה העליונה, העכורה והצהובה של PRP באמצעות פיפט זהיר דרך קצה פיפטה החתוך בזווית של 45 מעלות והשיגו את ספירת הטסיות באמצעות ספירת דם מלאה (CBC).
- במידת הצורך, יש לשטוף את טסיות הדם במי מלח נתרן 1,4-Piperazinediethanesulfonic חומצה (PIPES)-מלח חוצץ (150 mM נתרן כלורי, NaCl, 20 mM PIPES) בנוכחות פרוסטגלנדין E1 (PGE1), ולהשהות מחדש במאגר של Tyrode (134 mM NaCl, 0.34 mM די-נתרן מימן פוספט, Na2HPO4, 2.9 mM אשלגן כלורי, KCl, 1 mM מגנזיום כלורי, MgCl2, 5 mM גלוקוז, 12 mM סודיום ביקרבונט, NaHCO3, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה, HEPES, pH 7.35) עם 5 mM גלוקוז, אחרת, להמשיך לשלב 1.5. השלבים הבאים מתארים את הכביסה בקצרה.
- כוונן את נפח ה-PRP ל-10 מ"ל עם מי מלח חוצצים ב-PIPES והוסף PGE של 0.6 מיקרומטר1.
- צנטריפוגה למשך 8 דקות במהירות של 1,900 x גרם, ואז יש להשליך את הסופרנאטנט ולתת לגלולת הטסיות לשבת ב-400 מיקרוליטר של תמיסת טירוד וגלוקוז למשך 5 דקות.
- השהה בעדינות את גלולת הטסיות ושמור אותה ללא הפרעה למשך 30 דקות.
- התאם את ספירת הטסיות ל~ 250 x 103 טסיות למיקרוליטר עם פלזמה ענייה בטסיות אדם (PPP) ושמור על התרחיף ב 22 ° C ללא הפרעה או תחת סיבוב עדין.
2. טיפול נוגדנים וגזירה אחידה
הערה: כל השלבים בסעיף 2 הדורשים פיפטינג צריכים להיעשות לאט, כדי לא להכניס שום גזירה.
- מוסיפים את הנוגדן הרצוי ל-PRP או לטסיות הדם השטופות ומערבבים בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה או ערבוב עם קצה פיפטה. השאירו אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. הוסף נפח שווה ערך של PPP או מאגר Tyrode לפקד שלילי.
- הפעל את ויסקומטר צלחת החרוט, הגדר את טמפרטורת הצלחת ל -22 מעלות צלזיוס ואפשר זמן לתת לצלחת להגיע לטמפרטורה זו.
- פיפטה PRP מטופל או טסיות שטף על viscometer צלחת חרוט מבוקר טמפרטורה ישירות במרכז הצלחת. ודא שכל הדגימה מונחת בין החרוט לצלחת בנקודת המגע, ולא בצד החיצוני של שפת החרוט.
- גזירה בקצב ומשך מתאימים.
- חשב את ההטיה כפי שצוין במדריך הוויסקומטר, או כפי שהוצג קודם לכן.
- לקבוע את קצב הגזירה מהצמיגות ואת לחץ הגזירה הרצוי באמצעות חוק הצמיגות של ניוטון;
; צמיגות פלזמה היא 1.5-1.6 centipoise (cP). לדוגמה, טווח גזירה נורמלי למחזור הדם האנושי הוא 5-30 dyn/cm2, ויש להחיל גזירה על סקאלת הזמן החד-ספרתית של דקות.
- הרימו מעט את החרוט מהצלחת (~2 מ"מ) כך שהדגימה תישאר במגע הן עם הצלחת והן עם החרוט והשתמשו בהעמסת ג'ל או בקצה פיפטה ארוך אחר כדי לאסוף 5-10 μL ממרכז נפח הדגימה.
- דוגרים על הדגימות הגזורות עם הסמנים הרצויים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לסמנים של חשיפה לפוספטידיל-סרין, β-גלקטוז ו-P-selectin יש להשתמש בתחום לקטדרין C2 (LactC2) ב-0.08 מיקרומטר, ב-Erythrina cristagalli lectin (ECL) ב-6.25 מיקרוגרם/מ"ל ונוגדן אנטי-P-selectin (20 מיקרוגרם/מ"ל), בהתאמה.
- תקן דגימות בפרפורמאלדהיד 2% למשך 20 דקות ב- RT לפני דילול או אחסון קר והמשך לשלב 3.1 או אחסן דגימות ב- 4 ° C למשך לא יותר מ -12 שעות.
3. איתור סמני שטח והצלבה באמצעות ציטומטריית זרימה
- נתח את הדגימה באמצעות ציטומטריית זרימה, איסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל מצב.
- כמת את עוצמת האות של הסמנים הפלואורסצנטיים באמצעות ערך הגובה עבור העוצמה של כל פלואורופור, או עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הגיאומטרית (MFI).
- אם המטרה היא לזהות הצלבת טסיות לאחר טיפול גזירה, יש לנתח את הדגימה על ציטומטר זרימה המסוגל להדמיה ולכמת הצלבה לפי פרמטרים של יחס שטח וגובה-רוחב.
- התווה היסטוגרמה של שטח ו/או יחס גובה-רוחב.
- השתמש בבקרה שלילית עם אלבומין בסרום בקר (BSA) או רכב כדי לצייר שער למעט רוב האירועים המעגליים המלאים (שער זה משורטט בדרך כלל ביחס גובה-רוחב ~0.8) ולכמת את אחוז האירועים בתוך שער זה. אירועים עם יחס גובה-רוחב נמוך יותר נוטים יותר להיות מוצלבים.
